Rostlinné a patogenní materiály
Sorghum Association mapující populaci známou jako čiroková konverze populace (SCP) poskytl Dr. Pat Brown z University of Illinois (nyní na UC Davis).Byl popsán dříve a je sbírkou různých linií převedených na fotoperiodicky necitlivé a menšího vzrůstu, aby se usnadnil růst a vývoj rostlin v prostředí USA.V této studii bylo použito 510 linií z této populace, i když kvůli špatnému klíčení a dalším problémům s kontrolou kvality nebyly při analýze všech tří znaků použity všechny linie.Nakonec byla data z 345 linií použita pro analýzu chitinové odpovědi, 472 linií pro reakci flg22 a 456 pro TLS rezistenci.B. cookeikmen LSLP18 byl získán od Dr. Burta Bluhma z University of Arkansas.
Měření odezvy MAMP
V této studii byly použity dva různé MAMP flg22 (Genscript katalog # RP19986) a chitin.Rostliny čiroku byly pěstovány ve skleníku ve vložkách položených na plochách naplněných půdou (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix).Rostliny byly zalévány den před odběrem vzorků, aby se zabránilo nadměrné vlhkosti listů v den odběru.
Linie byly náhodně rozděleny a z logistických důvodů byly vysázeny v dávkách po 60 liniích.Pro každou linii byly vysázeny tři „hrnce“ se dvěma semeny na linii.Následující šarže byly vysazeny, jakmile byla zpracována předchozí šarže, dokud nebyla vyhodnocena celá populace.Byly provedeny dva experimentální běhy pro oba MAMP s genotypy rerandomizovanými v každém ze dvou běhů.
ROS testy byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve.Stručně řečeno, pro každou linii bylo zasazeno šest semen do 3 různých květináčů.Z výsledných sazenic byly vybrány tři na základě uniformity.Sazenice, které vypadaly neobvykle nebo byly výrazně vyšší nebo nižší než většina, nebyly použity.Čtyři listové disky o průměru 3 mm byly vyříznuty z nejširší části 4. listu tří různých 15 dnů starých rostlin čiroku.Jeden disk na list ze dvou rostlin a dva disky z jedné rostliny, přičemž druhý disk se stane kontrolou vody (viz níže).Disky byly jednotlivě plaveny na 50 ul H20 v černé 96-jamkové destičce, utěsněny hliníkovým těsněním, aby se zabránilo vystavení světlu, a udržovány přes noc při teplotě místnosti.Následující ráno byl připraven reakční roztok s použitím 2 mg/ml chemiluminiscenční sondy L-012 (Wako, katalogové č. 120-04891), 2 mg/ml křenové peroxidázy (Typ VI-A, Sigma-Aldrich, katalogové č. P6782) a 100 mg/ml chitinu nebo 2 uM Flg22.50 ul tohoto reakčního roztoku bylo přidáno do tří ze čtyř jamek.Čtvrtá jamka byla falešná kontrola, do které byl přidán reakční roztok s vyloučením MAMP.V každé destičce byly také zahrnuty čtyři prázdné jamky obsahující pouze vodu.
Po přidání reakčního roztoku byla luminiscence měřena pomocí SynergyTM 2 multidetekční čtečky mikrodestiček (BioTek) každé 2 minuty po dobu 1 hodiny.Čtečka destiček provádí měření luminiscence každé 2 minuty během této 1 hodiny.Byl vypočten součet všech 31 odečtů, aby se získala hodnota pro každou jamku.Odhadovaná hodnota pro MAMP odezvu pro každý genotyp byla vypočtena jako (průměrná hodnota luminiscence tří experimentálních jamek – hodnota falešné jamky) mínus průměrná hodnota slepé jamky.Hodnoty slepých jamek byly konzistentně blízké nule.
Listové kotouče zNicotiana benthamianaJedna vysoce citlivá linie čiroku (SC0003) a jedna linie čiroku s nízkou odezvou (PI 6069) byly také zahrnuty jako kontroly v každé 96jamkové destičce pro účely kontroly kvality.
B. cookeipříprava inokula a očkování
B. cookeiinokulum bylo připraveno tak, jak bylo popsáno dříve.Stručně řečeno, zrna čiroku byla namočena ve vodě po dobu tří dnů, opláchnuta, nabrána do 11 kuželových baněk a autoklávována po dobu jedné hodiny při 15 psi a 121 °C.Zrna pak byla naočkována asi 5 ml macerovaného mycelia z čerstvé kulturyB. cookeiLSLP18 se izoluje a nechá se 2 týdny při pokojové teplotě, každé 3 dny se protřepávají baňkami.Po 2 týdnech byla zrna čiroku napadená houbou usušena na vzduchu a poté skladována při 4 °C až do polní inokulace.Stejné inokulum bylo použito pro celý pokus a bylo vyrobeno čerstvé každý rok.Pro inokulaci bylo 6–10 napadených zrn umístěno do přeslenu 4–5 týdnů starých rostlin čiroku.Spory produkované těmito houbami iniciovaly infekci v mladých rostlinách čiroku během týdne.
Příprava semen
Před výsadbou na pole bylo osivo čiroku ošetřeno směsí fungicidu, insekticidu a safeneru obsahující ~ 1 % fungicidu Spirato 480 FS, 4 % fungicidu Sebring 480 FS, 3 % safeneru osiva Sorpro 940 ES.Poté byla semena sušena na vzduchu po dobu 3 dnů, což poskytlo tenký povlak této směsi kolem semen.Safener umožnil použití herbicidu Dual Magnum jako preemergentní ošetření.
Hodnocení odolnosti Target Leaf Spot
SCP byl vysazen na Central Crops Research Station v Clayton, NC ve dnech 14.–15. června 2017 a 20. června 2018 v randomizovaném kompletním blokovém designu se dvěma experimentálními replikacemi v každém případě.Pokusy byly zasazeny do 1,8 m jednotlivých řádků s šířkou řádku 0,9 m s použitím 10 semen na pozemek.Po obvodu každého experimentu byly vysázeny dvě hraniční řady, aby se zabránilo okrajovým efektům.Experimenty byly naočkovány 20. července 2017 a 20. července 2018, kdy byly rostliny čiroku ve fázi růstu 3. Hodnocení bylo provedeno na stupnici od jedné do devíti, kde rostliny nevykazující žádné známky onemocnění byly hodnoceny jako devět a zcela mrtvé rostliny byly hodnoceny jako jedna.Dvě hodnocení byla provedena v roce 2017 a čtyři odečty v roce 2018 počínaje každým rokem dva týdny po očkování.sAUDPC (standardizovaná plocha pod křivkou progrese onemocnění) byla vypočtena, jak bylo popsáno dříve.
Čas odeslání: duben-01-2021