Rostlinné a patogenní materiály
Populaci pro mapování asociací čiroku, známou jako konverzní populace čiroku (SCP), poskytl Dr. Pat Brown z University of Illinois (nyní na UC Davis). Byla popsána dříve a jedná se o soubor různých linií převedených na necitlivost k fotoperiodě a menší vzrůst, aby se usnadnil růst a vývoj rostlin v prostředí USA. V této studii bylo použito 510 linií z této populace, ačkoli kvůli špatné klíčivosti a dalším problémům s kontrolou kvality nebyly všechny linie použity při analýze všech tří znaků. Nakonec byla data z 345 linií použita pro analýzu chitinové odpovědi, 472 linií pro odpověď flg22 a 456 pro rezistenci TLS.B. cookeiKmen LSLP18 byl získán od Dr. Burta Bluhma z University of Arkansas.
Měření odezvy MAMP
V této studii byly použity dva různé MAMP flg22 (katalogové číslo Genscript: RP19986) a chitin. Rostliny čiroku byly pěstovány ve vložkách položených na plochách naplněných zeminou (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) ve skleníku. Rostliny byly zality den před odběrem vzorků, aby se zabránilo nadměrné vlhkosti listů v den odběru.
Linie byly randomizovány a z logistických důvodů vysazeny v dávkách po 60 liniích. Pro každou linii byly vysazeny tři „květináče“ se dvěma semeny na linii. Další dávky byly vysazeny, jakmile byla předchozí dávka zpracována, dokud nebyla vyhodnocena celá populace. Pro oba MAMP byly provedeny dva experimentální cykly s genotypy znovu randomizovanými v každém ze dvou cyklů.
ROS testy byly provedeny, jak bylo popsáno dříve. Stručně řečeno, pro každou linii bylo šest semen zaseto do 3 různých květináčů. Z výsledných sazenic byly vybrány tři na základě uniformity. Sazenice, které vypadaly neobvykle nebo byly výrazně vyšší či kratší než většina ostatních rostlin, nebyly použity. Z nejširší části 4. listu tří různých 15denních rostlin čiroku byly vyříznuty čtyři listové disky o průměru 3 mm. Jeden disk na list ze dvou rostlin a dva disky z jedné rostliny, přičemž druhý disk se stal kontrolní směsí (viz níže). Disky byly jednotlivě ponořeny do 50 µl H2O v černé 96jamkové destičce, utěsněny hliníkovým uzávěrem, aby se zabránilo vystavení světlu, a uchovávány přes noc při pokojové teplotě. Následujícího rána byl připraven reakční roztok s použitím 2 mg/ml chemiluminiscenční sondy L-012 (Wako, katalogové číslo 120-04891), 2 mg/ml křenové peroxidázy (typ VI-A, Sigma-Aldrich, katalogové číslo P6782) a 100 mg/ml chitinu nebo 2 μM Flg22. 50 µl tohoto reakčního roztoku bylo přidáno do tří ze čtyř jamek. Čtvrtá jamka sloužila jako kontrolní pokus, do kterého byl přidán reakční roztok bez MAMP. V každé destičce byly také zahrnuty čtyři slepé jamky obsahující pouze vodu.
Po přidání reakčního roztoku byla luminiscence měřena pomocí multidetekční čtečky mikrotitračních destiček Synergy™ 2 (BioTek) každé 2 minuty po dobu 1 hodiny. Čtečka destiček provádí měření luminiscence každé 2 minuty během této 1 hodiny. Součet všech 31 odečtů byl vypočítán pro získání hodnoty pro každou jamku. Odhadovaná hodnota odezvy MAMP pro každý genotyp byla vypočtena jako (průměrná hodnota luminiscence ze tří experimentálních jamek – hodnota z kontrolní jamky) mínus průměrná hodnota z jamky slepé. Hodnoty z jamek slepé jamky byly konzistentně blízké nule.
Listové diskyNicotiana benthamiana, jedna vysoce responzivní linie čiroku (SC0003) a jedna nízkoresponzivní linie čiroku (PI 6069) byly také zahrnuty jako kontroly do každé 96jamkové destičky pro účely kontroly kvality.
B. cookeipříprava inokula a inokulace
B. cookeiInokulum bylo připraveno dle dříve popsaného postupu. Stručně řečeno, zrna čiroku byla namočena na tři dny do vody, opláchnuta, nabrána do 1litrových Erlenmeyerových baněk a autoklávována po dobu jedné hodiny při tlaku 15 psi a teplotě 121 °C. Zrna byla poté naočkována přibližně 5 ml macerovaného mycelia z čerstvé kultury.B. cookeiIzoláty LSLP18 a ponechány 2 týdny při pokojové teplotě, přičemž se baňky každé 3 dny protřepávaly. Po 2 týdnech byla zrna čiroku napadená houbou usušena na vzduchu a poté skladována při 4 °C až do inokulace na poli. Stejné inokulum bylo použito po celou dobu pokusu a každý rok se připravovalo čerstvé. Pro inokulaci bylo 6–10 napadených zrn umístěno do přeslenu 4–5 týdnů starých rostlin čiroku. Spory produkované těmito houbami vyvolaly infekci u mladých rostlin čiroku během jednoho týdne.
Příprava osiva
Před výsadbou na pole byla semena čiroku ošetřena směsí fungicidu, insekticidu a safeneru obsahující ~ 1 % fungicidu Spirato 480 FS, 4 % fungicidu Sebring 480 FS a 3 % safeneru Sorpro 940 ES. Poté byla semena sušena na vzduchu po dobu 3 dnů, což zajistilo tenkou vrstvu této směsi kolem semen. Safener umožnil použití herbicidu Dual Magnum jako preemergentního ošetření.
Hodnocení rezistence k cílové skvrnitosti listů
Semena čiroku byla vysazena v Central Crops Research Station v Claytonu v Severní Karolíně ve dnech 14. a 15. června 2017 a 20. června 2018 v randomizovaném blokovém schématu se dvěma experimentálními replikacemi v každém případě. Experimenty byly vysazeny do jednotlivých řádků o rozteči 1,8 m s šířkou řádku 0,9 m s použitím 10 semen na parcelu. Po obvodu každého experimentu byly vysazeny dva okrajové řádky, aby se zabránilo okrajovým efektům. Experimenty byly naočkovány 20. července 2017 a 20. července 2018, kdy se rostliny čiroku nacházely ve fázi růstu 3. Hodnocení bylo provedeno na stupnicích od jedné do devíti, kde rostliny nevykazující žádné známky choroby byly hodnoceny jako devět a zcela mrtvé rostliny jako jedna. V roce 2017 byla provedena dvě hodnocení a v roce 2018 čtyři odečty, počínaje dva týdny po inokulaci každý rok. sAUDPC (standardizovaná plocha pod křivkou progrese choroby) byla vypočtena, jak bylo popsáno dříve.
Čas zveřejnění: 1. dubna 2021