Pesticidy hrají klíčovou roli v řešení globálního nedostatku potravin a v boji proti nemocem přenášeným vektory. Rostoucí problém rezistence na pesticidy však naléhavě vyžaduje objevení nových sloučenin, které cílí na nedostatečně využívané cíle. Kanály TRPV (Insect transient receptor potential) – Nanzhong (Nan) a inaktivní (Iav) – mohou tvořit heterologní kanály (Nan-Iav) a lokalizovat se v mechanosenzorických orgánech, které zprostředkovávají geotropismus, sluch a propriocepci u hmyzu. Některé pesticidy, jako je afidopyrrolidon (AP), cílí na Nan-Iav neznámými mechanismy. AP je účinný proti bodavě sajícímu hmyzu (Hemiptera), který brání krmení narušením funkce filament. AP se může vázat pouze na Nan, ale pouze Nan-Iav může interagovat s agonisty, včetně endogenního nikotinamidu (NAM), a tím vykazuje aktivitu kanálů. Navzdory potenciálu Nan-Iav jako cíle insekticidů je o sestavování jeho kanálů, regulačních vazebných místech a regulaci závislé na Ca2+ známo jen málo, což brání dalšímu vývoji insekticidů. V této studii byla použita kryoelektronová mikroskopie ke stanovení struktury Nan-Iav u hmyzu rodu Hemiptera ve stavu bez kalmodulinového ligandu, stejně jako s AP a NAM na hranici cytoplazmatické domény ankyrinových repetic (ARD). Překvapivě jsme zjistili, že samotný protein Nan může tvořit pentamer, který je stabilizován interakcemi ARD zprostředkovanými AP. Tato studie odhaluje molekulární interakce mezi insekticidy a agonisty a Nan-Iav, zdůrazňuje význam ARD ve funkci a sestavování kanálů a zkoumá mechanismus regulace Ca2+.
Na pozadí stále závažnějších globálních klimatických změn je zhoršující se globální potravinová bezpečnost jednou z hlavních výzev 21. století s kaskádovitými důsledky pro společnost.1,2Zpráva Světové zdravotnické organizace o stavu potravinové bezpečnosti a výživy ve světě v roce 2023 (SOFI) odhaduje, že přibližně 2,33 miliardy lidí na celém světě trpí středně těžkou až těžkou potravinovou nejistotou, což je dlouhodobý problém.3,4Bohužel se odhaduje, že každoročně dojde ke ztrátě 20 % až 30 % nebo i více výnosů plodin kvůli škůdcům a patogenům a očekává se, že globální oteplování zhorší odolnost vůči škůdcům a zranitelnost plodin.4, 5, 6, 7, 8Vývoj pesticidů je zásadní nejen pro ochranu plodin před škůdci a snížení šíření patogenů přenášených vektory, ale také pro boj s lidskými nemocemi přenášenými vektory, jako je horečka dengue, malárie a Chagasova choroba, které jsou stále více odolné vůči pesticidům.5, 9, 10, 11
Mezi hlavní cíle neurotoxických insekticidů patří heterotetramerní TRPV kanál Nanchung (Nan)-Inactive (Iav), který představuje třídu insekticidní cíle objevené teprve v posledním desetiletí, včetně komerčně dostupných insekticidů, jako je imidakloprid a pyraklostrobin.12, 13, 14Polosyntetický insekticid aphidopyrrolifen (AP) je nedávno vyvinutý a komerčně dostupný produkt, jehož hlavní složkou je aktivní insekticid Inscalis®, který se váže na AP s aktivitou v subnanomolárních číslech.15AP vykazuje nízkou akutní toxicitu pro opylovače, užitečný hmyz a další necílové organismy a při použití dle pokynů na etiketě může snížit rezistenci vůči jiným insekticidům.16, 17, 18Nan a Iav jsou široce rozšířené napříč druhy hmyzu, jsou koexprimovány pouze v neuronech receptorů pro natažení chordálů v tykadlech a končetinách a jsou klíčové pro sluch, vnímání gravitace a propriocepci.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid a pyraklostrobin stimulují komplex Nan-Iav jedinečným mechanismem, což v konečném důsledku inhibuje proprioceptivní signální transdukci.13, 16, 23U hmyzu sajícího bodnutím a sajícího hmyzu (polohlavců), jako jsou mšice a molice, ztráta propriocepce zhoršuje jejich schopnost potravy, což nakonec vede k úhynu.13,24Je zajímavé, že AP vykazuje vysokou afinitu ke komplexu Nan-Iav a nízkou afinitu k samotnému Nan. Vazba AP na Nan-Iav indukuje elektrický proud, ale vazba na samotný Nan nestimuluje aktivitu kanálu. Samotný Iav se na AP vůbec neváže.16To naznačuje, že Nan a Iav se mohou vázat za vzniku různých kanálových komplexů Nan-Iav (např. s různými stechiometrickými poměry nebo různým uspořádáním v rámci stejného stechiometrického poměru), nebo že se AP může vázat na více míst. Navíc se přirozený agonista nikotinamid (NAM) váže na Nan-Iav u drozofily s mikromolární afinitou a vykazuje podobné účinky jako mšice (AP) in vitro.16,25a potlačování rozmnožování a krmení mšic, což nakonec vede k jejich úhynu25,26Tato data vyvolávají mnoho otázek. Například zůstává nejasné, jak se tvoří heterodimer Nan-Iav, která vazebná místa se používají k modulaci malých molekul a jak tyto malé molekuly regulují funkci kanálů potlačením propriocepce. Dále zůstávají nejasné důvody, proč je samotný Nan neaktivní a má nízkou afinitu k AP, zatímco heterodimer Nan-Iav je aktivní a váže AP s vyšší afinitou. A konečně, je málo známo o regulaci funkce Nan-Iav závislé na Ca2+ a o tom, jak je integrována do neuronálních signálních procesů.13,21
V této studii jsme kombinací kryoelektronové mikroskopie, elektrofyziologie a technik vazby radioligandů objasnili sestavení Nan-Iav a mechanismus jeho vazby na regulátory s malými molekulami. Dále jsme detekovali konstitutivně vázaný kalmodulin (CaM) na Iav a AP-stabilizované pentamery Nan. Tyto výsledky poskytují důležité poznatky o regulaci vápenatých iontů v kanálech, sestavení kanálů a faktorech určujících vazebnou afinitu ligandu. A co je důležitější, potvrdili jsme, že ARD hraje v těchto procesech ústřední roli. Naše studie kompletních hmyzích kanálů vázaných na relevantní zemědělské pesticidy27, 28, 29otevírá perspektivy pro rozvoj pesticidního průmyslu, zlepšuje účinnost a specifičnost pesticidů a umožňuje aplikaci sloučenin zaměřených na TRPV na jiné druhy s cílem řešit globální potravinovou bezpečnost a šíření chorob přenášených vektory.
Zjistili jsme také, že Nan-Iav je regulován Ca2+ a mechanismus regulace je zprostředkován konstitutivně vázaným CaM. Důležité je, že tato Ca2+-dependentní regulace Nav pomocí CaM se významně liší od mechanismů regulace jiných iontových kanálů (např. napěťově řízených Na+ kanálů a TRPV5/6 kanálů).52, 53, 54, 55, 56, 57V kanálu Nav1.2 se C-terminální doména CaM helikálně asociuje s C-terminální doménou (CTD) a Ca2+ indukuje vazbu své N-terminální domény na distální část CTD.56V kanálu TRPV5/6 se C-terminální doména CaM váže na CTH a Ca2+ indukuje vzestupné prodloužení své N-terminální domény do póru, čímž blokuje propustnost kationtů.53,54Navrhujeme model pro funkci Nan-Iav-CaM regulovanou Ca2+ (obr. 4h). V tomto modelu se N-terminální doména CaM konstitutivně váže na C-terminální doménu (CTH) Iav. V klidovém stavu (nízká koncentrace [Ca2+]) interaguje C-terminální doména CaM s Nan, čímž stabilizuje konformaci ARD a tím podporuje otevření kanálu. Vazba agonisty/insekticidu na kanál indukuje otevření pórů, což vede k přítoku Ca2+. Ca2+ se poté váže na CaM, což způsobuje disociaci C-terminální domény od ARD Nan. Protože blokování vazby CaM v podstatě ruší inhibiční účinek Ca2+, tato disociace moduluje mobilitu ARD, čímž způsobuje inhibici nebo desenzibilizaci závislou na Ca2+. Rychlé obnovení proudů kanálu po eluci vápenatých iontů (obr. 4g) naznačuje, že tento mechanismus usnadňuje rychlé reakce na neuronální signály zprostředkované Ca2+. Kromě toho bylo zjištěno, že C-terminální oblast proteinu Iav, která je stále málo pochopena, hraje další role v cílení kanálů a regulaci proudu.21
Naše studie nakonec představuje strukturu s vysokým rozlišením komplexu TRP kanálů insekticid-insekticid, který má zemědělský význam – objev, který nám dosud nebyl znám. Je pozoruhodné, že jsme charakterizovali strukturu a funkci hmyzího kanálu v lidských buňkách (HEK293S GnTi–), spíše než v hmyzích buňkách. Vzhledem k rostoucí rezistenci vůči insekticidům a neustálému tlaku na potravinovou bezpečnost a patogeny naše práce poskytuje důležité informace, které usnadní vývoj nových insekticidů ve prospěch lidského zdraví a globální potravinové bezpečnosti. Studie ukázaly, že insekticidy, jako je AP, jsou účinné proti některým škůdcům, pokud se používají podle pokynů na etiketě, a mají nízkou akutní toxicitu pro užitečné opylovače, což dokazuje jejich bezpečnost pro životní prostředí.13,16Testování některých derivátů AP na komárech navíc ukázalo, že ti nakonec ztrácejí schopnost létat. Pochopení toho, jak se tyto modulační sloučeniny vážou na Nan-Iav, usnadní modifikaci stávajících sloučenin nebo vývoj nových sloučenin pro účinnější a...přesnýhubení škůdců. Naše studie ukazuje, že rozhraní Nan-Iav ARD je klíčové nejen pro regulaci aktivity endogenních sloučenin, pesticidů a Ca2+-CaM, ale také pro sestavování kanálů. Domníváme se, že narušení sestavování heterodimerů malými molekulami by mohlo být jedinečným a slibným přístupem k vývoji inhibitorů iontových kanálů.
Z osmi ortologních genů byly vybrány geny hnědého brouka (Halyomorpha halys) Nanchung a Inactive v plné délce, které vykazují vynikající stabilitu v detergentech. Syntetizované geny byly kodonově optimalizovány pro lidskou expresi a klonovány do vektoru pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) za použití restrikčních míst XhoI a EcoRI. To zajistilo, že klony byly v čtecím rámci s C-terminálními značkami GFP-FLAG-10xHis a mCherry-FLAG-10xHis, které jsou štěpeny proteázou HRC-3C (PPX), což umožňuje nezávislévýrazPrimery použité pro klonování Nanchung a Inactive do vektoru pBacMam byly následující:
Mikroskopické snímky jednotlivých částic byly pořízeny na transmisním elektronovém mikroskopu Titan Krios G2 (FEI) vybaveném kamerou K3 a energetickým filtrem Gatan BioQuantum. Mikroskop pracoval při energii 300 keV, nastavení energie 20 eV, velikosti pixelu vzorku 1,08 Å/pixel (nominální zvětšení 81 000x) a gradientu rozostření v rozmezí od -0,8 do -2,2 μm. Videozáznam byl prováděn rychlostí 40 snímků za sekundu pomocí mikroskopu Latitude S (Gatan) s nominálním dávkovým příkonem 25 e–px−1 s−1, expoziční dobou 2,4 s a celkovou dávkou přibližně 60 e–Å−2.
Korekce pohybu indukovaného paprskem a dávkové vážení byly provedeny na filmu pomocí MotionCor2 v programu RELION 4.061. Odhad parametru funkce přenosu kontrastu (CTF) byl proveden v programu cryoSPARC s použitím metody odhadu CTF založené na patchích62. Z následné analýzy byly vyloučeny fotomikrofotografie s rozlišením CTF fitování ≥4 Å. Typicky byla pro výběr bodů v programu cryoSPARC použita podmnožina 500–1000 fotomikrofotografií, po níž po filtrování následovalo několik kol 2D klasifikace za účelem získání jasného referenčního obrazu pro výběr částic na základě šablony. Částice byly poté extrahovány pomocí 64pixelových ohraničujících rámečků a 4násobného binningu. Bylo provedeno několik kol 2D klasifikace za účelem odstranění nežádoucích kategorií částic. Počáteční 3D model byl rekonstruován pomocí ab initio rekonstrukce a zpřesněn pomocí neuniformního zpřesnění v programu cryoSPARC. 3D klasifikace byla provedena v programu cryoSPARC nebo RELION na základě heterogenity ARD. Nebyla pozorována žádná významná heterogenita membránových domén. Částice byly zpřesněny metodami C1 a C2; Částice s vyšším rozlišením C2 byly považovány za symetrické vzhledem k C2 a importovány do programu RELION pro Bayesovské zpřesnění. Částice byly poté přeneseny zpět do programu cryoSPARC pro finální nerovnoměrné a lokální zpřesnění. Konečné rozlišení a počet částic jsou uvedeny v tabulce 1.
Při zpracování pentamerů Nan+AP jsme zkoumali různé metody pro zlepšení rozlišení membránových domén (zejména oblasti pórů), jako je odečítání signálu a maskování TMD. Tyto pokusy však byly neúspěšné kvůli potenciálně extrémní neuspořádanosti v oblasti pórů a celkové heterogenitě TMD. Konečné rozlišení bylo vypočítáno pomocí masky automaticky generované metodou neuniformního zpracování v cryoSPARC, primárně zaměřené na oblast ARD. Tím bylo dosaženo výrazně vyššího rozlišení než u membránových domén (zejména oblasti VSLD).
Počáteční de novo modely apo forem bakterií Nanchung a Inactive byly nejprve generovány pomocí Coot63 a modely bakterií Nan a Iav byly generovány pomocí AlphaFold264 pro identifikaci oblastí s nízkou spolehlivostí. Modelování kalmodulinu bylo založeno na rigidních tělesových fitech modelů s vazbou Ca2+ a bez Ca2+ v PDB accessions 4JPZ56 a 1CFD65. Modely byly upřesněny pomocí sférického upřesnění, aby byla zajištěna správná stereochemie a dobrá geometrie. Fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin a fosfatidylserin byly poté modelovány jako dobře definované lipidové hustoty a ligandy NAM a AP byly umístěny do odpovídajících hustot v těsných spojích. Soubory s omezeními byly generovány z řetězce SMILES izoforem pomocí eLBOW v PHENIX66. Nakonec byly modely upřesněny v reálném prostoru v PHENIX pomocí lokálního vyhledávání v mřížce a globální minimalizace s omezeními sekundární struktury. Pro zpřesnění modelu a strukturní analýzu byl použit server MolProbity a ilustrace byly provedeny pomocí PyMOL a UCSF Chimera X. 67,68,69 Analýza apertury byla provedena pomocí serveru HOLE,70 a mapování konzervace sekvencí bylo provedeno pomocí serveru Consurf.71
Statistická analýza byla provedena pomocí programů Igor Pro 6.2, Excel Office 365 a GraphPad Prism 7.0. Všechna kvantitativní data jsou prezentována jako průměr ± směrodatná chyba (SEM). Pro porovnání dvou skupin byl použit Studentův t-test (oboustranný, nepárový). Pro porovnání více skupin byla použita jednocestná analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Dunnettovým post hoc testem. *P< 0,05, **P< 0,01 a ***PHodnoty < 0,001 byly považovány za statisticky významné v závislosti na rozdělení dat. Hodnoty Kd a Ki a jejich asymetrické 95% intervaly spolehlivosti byly vypočítány pomocí programu GraphPad Prism 10.
Více informací o metodologii studie naleznete v souhrnu zprávy o portfoliu přírody, na který odkazuje tento článek.
Počáteční model byl sestaven s využitím modelů kalmodulinu z databází PDB 4JPZ a 1CFD. Souřadnice byly uloženy v Protein Data Bank (PDB) pod evidenčními čísly 9NVN (Nan-Iav-CaM bez ligandu), 9NVO (Nan-Iav-CaM vázaný na nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM vázaný na nikotinamid a EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM vázaný na afenidolpyrrolin a vápník), 9NVR (Nan-Iav-CaM vázaný na afenidolpyrrolin a EDTA) a 9NVS (Nan pentamer vázaný na afenidolpyrrolin). Odpovídající snímky z kryoelektronové mikroskopie jsou uloženy v databázi elektronové mikroskopie (EMDB) pod následujícími evidenčními čísly: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bez ligandu), EMD-49845 (komplex Nan-Iav-CaM s nikotinamidem), EMD-49846 (komplex Nan-Iav-CaM s nikotinamidem a EDTA), EMD-49847 (komplex Nan-Iav-CaM s afidopyrrolinem a vápníkem), EMD-49848 (komplex Nan-Iav-CaM s afidopyrrolinem a EDTA) a EMD-49849 (komplex Nan pentamer s afidopyrrolinem). V tomto článku jsou prezentována nezpracovaná data pro funkční analýzu.
Čas zveřejnění: 28. ledna 2026