V předchozím projektu testujícím místní závody na zpracování potravin na komáry v Thajsku se zjistilo, že esenciální oleje (EO) z rostliny Cyperus rotundus, galangal a skořice mají dobrou účinnost proti komárům proti Aedes aegypti. Ve snaze omezit používání tradičníchinsekticidya zlepšit kontrolu populací rezistentních komárů, cílem této studie bylo identifikovat potenciální synergismus mezi adulticidními účinky ethylenoxidu a toxicitou permethrinu na komáry rodu Aedes aegypti, včetně kmenů rezistentních a citlivých na pyrethroidy.
Vyhodnotit chemické složení a účinnost EO extrahovaného z oddenků C. rotundus a A. galanga a kůry C. verum proti citlivému kmenu Muang Chiang Mai (MCM-S) a rezistentnímu kmenu Pang Mai Dang (PMD-R). ) Aktivní dospělí jedinci Ae. Aedes aegypti. U těchto komárů rodu Aedes byl také proveden biologický test směsi EO a permethrinu na dospělých jedincích, aby se pochopila její synergická aktivita. kmeny aegypti.
Chemická charakterizace pomocí analytické metody GC-MS ukázala, že z esenciálních olejů (EO) C. rotundus, A. galanga a C. verum bylo identifikováno 48 sloučenin, které představují 80,22 %, 86,75 % a 97,24 % z celkového množství složek. Cyperen (14,04 %), β-bisabolen (18,27 %) a cinnamaldehyd (64,66 %) jsou hlavními složkami cyperusového oleje, galangalového oleje a balsamikového oleje. V biologických testech usmrcování dospělých jedinců byly EV C. rotundus, A. galanga a C. verum účinné při usmrcování Ae. aegypti. Hodnoty LD50 MCM-S a PMD-R byly 10,05 a 9,57 μg/mg u samic, 7,97 a 7,94 μg/mg u samic a 3,30 a 3,22 μg/mg u samic. Účinnost MCM-S a PMD-R Ae při usmrcování dospělých komárů rodu Aegypti v těchto EO byla blízká piperonylbutoxidu (hodnoty PBO, LD50 = 6,30 a 4,79 μg/mg u samic), ale nebyla tak výrazná jako u permethrinu (hodnoty LD50 = 0,44 a 3,70 ng/mg u samic). Kombinované biologické testy však zjistily synergii mezi EO a permethrinem. Významný synergismus s permethrinem proti dvěma kmenům komárů rodu Aedes. Aedes aegypti byl zaznamenán v EM komárů C. rotundus a A. galanga. Přidání olejů z C. rotundus a A. galanga významně snížilo hodnoty LD50 permethrinu na MCM-S z 0,44 na 0,07 ng/mg a 0,11 ng/mg u samic, s hodnotami synergického poměru (SR) 6,28 a 4,00. Kromě toho esenciální oleje z C. rotundus a A. galanga také významně snížily hodnoty LD50 permethrinu na PMD-R z 3,70 na 0,42 ng/mg a 0,003 ng/mg u samic, s hodnotami SR 8,81 a 1233,33.
Synergický účinek kombinace EO a permethrinu pro zvýšení toxicity pro dospělé komáry proti dvěma kmenům Aedes. Aedes aegypti prokazuje slibnou roli ethylenoxidu jako synergistu při zvyšování účinnosti proti komárům, zejména tam, kde jsou tradiční sloučeniny neúčinné nebo nevhodné.
Komár Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) je hlavním přenašečem horečky dengue a dalších infekčních virových onemocnění, jako je žlutá zimnice, chikungunya a virus Zika, a představuje obrovskou a přetrvávající hrozbu pro člověka [1, 2]. Virus dengue je nejzávažnější patogenní hemoragickou horečkou postihující člověka. Ročně se odhaduje na 5–100 milionů případů a ohroženo je více než 2,5 miliardy lidí na celém světě [3]. Ohniska této infekční choroby představují obrovskou zátěž pro obyvatelstvo, zdravotnické systémy a ekonomiky většiny tropických zemí [1]. Podle thajského ministerstva zdravotnictví bylo v roce 2015 v celé zemi hlášeno 142 925 případů horečky dengue a 141 úmrtí, což je více než trojnásobek počtu případů a úmrtí v roce 2014 [4]. Navzdory historickým důkazům byla horečka dengue vymýcena nebo výrazně snížena komárem Aedes. Po zvládnutí Aedes aegypti [5] se míra infekce dramaticky zvýšila a nemoc se rozšířila po celém světě, částečně v důsledku desetiletí globálního oteplování. Eliminace a kontrola Ae. Aedes aegypti je relativně obtížná, protože se jedná o domácího komára, který se páří, živí, odpočívá a klade vajíčka v lidských obydlích a jejich okolí během dne. Kromě toho se tento komár dokáže přizpůsobit změnám prostředí nebo narušení způsobeným přírodními událostmi (jako je sucho) nebo lidskými kontrolními opatřeními a může se vrátit k původnímu počtu [6, 7]. Vzhledem k tomu, že vakcíny proti horečce dengue byly schváleny teprve nedávno a neexistuje žádná specifická léčba horečky dengue, závisí prevence a snižování rizika přenosu dengue výhradně na kontrole komárů, kteří je přenašeči, a eliminaci kontaktu lidí s nimi.
Zejména používání chemikálií pro hubení komárů nyní hraje důležitou roli ve veřejném zdraví jako důležitá součást komplexní integrované regulace přenašečů. Mezi nejoblíbenější chemické metody patří použití nízkotoxických insekticidů, které působí proti larvám komárů (larvicidy) a dospělým komárům (adidocidy). Regulace larev prostřednictvím snižování zdrojů a pravidelného používání chemických larvicidů, jako jsou organofosfáty a regulátory růstu hmyzu, je považována za důležitou. Nepříznivé dopady na životní prostředí spojené se syntetickými pesticidy a jejich pracná a složitá údržba však zůstávají velkým problémem [8, 9]. Tradiční aktivní regulace přenašečů, jako je regulace dospělých komárů, zůstává nejúčinnějším prostředkem kontroly během virových ohnisek, protože dokáže rychle a ve velkém měřítku eradikovat přenašeče infekčních onemocnění a také zkrátit životnost místních populací přenašečů [3]. , 10]. Základem programů regulace přenašečů tvoří čtyři třídy chemických insekticidů: organochloriny (označované pouze jako DDT), organofosfáty, karbamáty a pyrethroidy, přičemž pyrethroidy jsou považovány za nejúspěšnější třídu. Jsou vysoce účinné proti různým členovcům a mají nízkou účinnost. V současné době tvoří syntetické pyrethroidy většinu komerčních pesticidů a představují přibližně 25 % světového trhu s pesticidy [11, 12]. Permethrin a deltamethrin jsou širokospektrální pyrethroidní insekticidy, které se po celá desetiletí používají po celém světě k hubení různých škůdců zemědělského a lékařského významu [13, 14]. V 50. letech 20. století byl DDT vybrán jako chemická látka preferovaná pro thajský národní program kontroly komárů v oblasti veřejného zdraví. Po širokém používání DDT v oblastech s endemickým výskytem malárie Thajsko postupně v letech 1995 až 2000 DDT vyřazovalo a nahradilo ho dvěma pyrethroidy: permethrinem a deltamethrinem [15, 16]. Tyto pyrethroidní insekticidy byly zavedeny na začátku 90. let 20. století k hubení malárie a horečky dengue, a to především ošetřením moskytiérami a používáním tepelných mlh a sprejů s ultra nízkou toxicitou [14, 17]. Jejich účinnost však klesla kvůli silné rezistenci komárů a nedostatečnému dodržování předpisů ze strany veřejnosti v důsledku obav o veřejné zdraví a dopad syntetických chemikálií na životní prostředí. To představuje značné výzvy pro úspěch programů na kontrolu vektorů hrozeb [14, 18, 19]. Aby byla strategie účinnější, jsou nezbytná včasná a vhodná protiopatření. Doporučené postupy řízení zahrnují nahrazování přírodních látek, rotaci chemikálií různých tříd, přidávání synergistů a míchání chemikálií nebo současnou aplikaci chemikálií různých tříd [14, 20, 21]. Proto je naléhavě nutné najít a vyvinout ekologickou, pohodlnou a účinnou alternativu a synergist a tato studie si klade za cíl tuto potřebu řešit.
Insekticidy přírodního původu, zejména ty, které jsou založeny na rostlinných složkách, prokázaly potenciál při hodnocení současných i budoucích alternativ v oblasti hubení komárů [22, 23, 24]. Několik studií ukázalo, že je možné kontrolovat důležité přenašeče komárů pomocí rostlinných produktů, zejména esenciálních olejů (EO), jakožto herbicidů. Adulticidní vlastnosti proti některým důležitým druhům komárů byly zjištěny u mnoha rostlinných olejů, jako je celer, kmín, zedoaria, anýz, paprika, tymián, Schinus terebinthifolia, Cymbopogon citratus, Cymbopogon schoenanthus, Cymbopogon giganteus, Chenopodium ambrosioides, Cochlospermum planchonii, Eucalyptus ter eticornis, Eucalyptus citriodora, Cananga odorata a Petroselinum Criscum [25,26,27,28,29,30]. Ethylenoxid se nyní používá nejen samostatně, ale také v kombinaci s extrahovanými rostlinnými látkami nebo stávajícími syntetickými pesticidy, což vede k různým stupňům toxicity. Kombinace tradičních insekticidů, jako jsou organofosfáty, karbamáty a pyrethroidy, s ethylenoxidem/rostlinnými extrakty působí synergicky nebo antagonisticky ve svých toxických účincích a prokázaly se jako účinné proti přenašečům chorob a škůdcům [31, 32, 33, 34, 35]. Většina studií o synergických toxických účincích kombinací fytochemikálií se syntetickými chemikáliemi nebo bez nich však byla provedena na zemědělských hmyzích přenašečích a škůdcích spíše než na lékařsky významných komárech. Navíc se většina prací o synergických účincích kombinací rostlinných a syntetických insekticidů proti přenašečům komárů zaměřila na larvicidní účinek.
V předchozí studii provedené autory v rámci probíhajícího výzkumného projektu zaměřeného na screening intimicidů z původních potravinářských rostlin v Thajsku bylo zjištěno, že ethylenoxidy z Cyperus rotundus, galangalu a skořice mají potenciální aktivitu proti dospělým druhům Aedes. Egypt [36]. Cílem této studie bylo proto vyhodnotit účinnost esenciálních olejů izolovaných z těchto léčivých rostlin proti komárům rodu Aedes. aegypti, včetně kmenů rezistentních a citlivých na pyrethroidy. Synergický účinek binárních směsí ethylenoxidu a syntetických pyrethroidů s dobrou účinností u dospělých byl také analyzován s cílem snížit používání tradičních insekticidů a zvýšit odolnost vůči komárům přenašečům, zejména proti Aedes. Aedes aegypti. Tento článek popisuje chemickou charakterizaci účinných esenciálních olejů a jejich potenciál zvýšit toxicitu syntetického permethrinu proti komárům rodu Aedes. aegypti u kmenů citlivých na pyrethroidy (MCM-S) a rezistentních kmenů (PMD-R).
Oddenky druhů C. rotundus a A. galanga a kůra druhu C. verum (obr. 1) použité k extrakci esenciálního oleje byly zakoupeny od dodavatelů bylinných léčiv v provincii Chiang Mai v Thajsku. Vědecká identifikace těchto rostlin byla provedena na základě konzultace s panem Jamesem Franklinem Maxwellem, herbářovým botanikem, katedry biologie, Přírodovědecké fakulty Univerzity Chiang Mai (CMU) v provincii Chiang Mai v Thajsku, a vědkyní Wannari Charoensapovou; na Farmaceutické fakultě Carnegie Mellon University jsou paní Voucherová vzorky každé rostliny uloženy na katedře parazitologie Lékařské fakulty Carnegie Mellon University pro budoucí použití.
Vzorky rostlin byly sušeny jednotlivě ve stínu po dobu 3–5 dnů v otevřeném prostoru s aktivní ventilací a okolní teplotou přibližně 30 ± 5 °C, aby se odstranila vlhkost před extrakcí přírodních esenciálních olejů (EO). Celkem 250 g každého suchého rostlinného materiálu bylo mechanicky rozemleto na hrubý prášek a použito k izolaci esenciálních olejů (EO) parní destilací. Destilační aparatura se skládala z elektrického topného pláště, baňky s kulatým dnem o objemu 3000 ml, extrakční kolony, chladiče a zařízení Cool ace (Eyela Cool Ace CA-1112 CE, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokio, Japonsko). Do baňky se přidá 1600 ml destilované vody a 10–15 skleněných kuliček a poté se baňka zahřívá na přibližně 100 °C pomocí elektrického ohřívače po dobu alespoň 3 hodin, dokud destilace není dokončena a nevznikají žádné další esenciální oleje. Vrstva EO byla oddělena od vodné fáze pomocí dělicího trychtýře, sušena nad bezvodým síranem sodným (Na2SO4) a skladována v uzavřené hnědé lahvi při 4 °C do doby, než bylo zkoumáno chemické složení a aktivita u dospělých jedinců.
Chemické složení esenciálních olejů bylo provedeno současně s biologickým testem na dospělou substanci. Kvalitativní analýza byla provedena za použití systému GC-MS, který se skládal z plynového chromatografu Hewlett-Packard (Wilmington, CA, USA) 7890A vybaveného jedním kvadrupólovým hmotnostně selektivním detektorem (Agilent Technologies, Wilmington, CA, USA) a MSD 5975C (EI) (Agilent Technologies).
Chromatografická kolona – DB-5MS (30 m × vnitřní průměr 0,25 mm × tloušťka filmu 0,25 µm). Celková doba GC-MS byla 20 minut. Podmínky analýzy jsou: teplota injektoru a přenosové linky je 250 °C, respektive 280 °C; teplota pece je nastavena tak, aby se zvyšovala z 50 °C na 250 °C rychlostí 10 °C/min, nosný plyn je hélium; průtok 1,0 ml/min; objem injektovaného plynu je 0,2 µl (1/10 % objemových v CH2Cl2, dělicí poměr 100:1); Pro detekci GC-MS je použit elektronový ionizační systém s ionizační energií 70 eV. Rozsah snímání je 50–550 atomových hmotnostních jednotek (amu) a rychlost skenování je 2,91 skenů za sekundu. Relativní procentuální zastoupení složek je vyjádřeno jako procenta normalizovaná podle plochy píku. Identifikace složek EO je založena na jejich retenčním indexu (RI). RI byl vypočítán pomocí rovnice Van den Doola a Kratze [37] pro řadu n-alkanů (C8-C40) a porovnán s retenčními indexy z literatury [38] a knihovních databází (NIST 2008 a Wiley 8NO8). Identita zobrazených sloučenin, jako je struktura a molekulární vzorec, byla potvrzena porovnáním s dostupnými autentickými vzorky.
Analytické standardy pro syntetický permethrin a piperonylbutoxid (PBO, pozitivní kontrola v synergických studiích) byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Testovací soupravy pro dospělé Světové zdravotnické organizace (WHO) a diagnostické dávky papíru impregnovaného permethrinem (0,75 %) byly komerčně zakoupeny od Centra pro kontrolu vektorů WHO v Penangu v Malajsii. Všechny ostatní použité chemikálie a činidla byly analytické kvality a byly zakoupeny od místních institucí v provincii Chiang Mai v Thajsku.
Komáři použití jako testovací organismy v biotestu pro dospělé jedince byli volně se pářící laboratorní komáři rodu Aedes. aegypti, včetně citlivého kmene Muang Chiang Mai (MCM-S) a rezistentního kmene Pang Mai Dang (PMD-R). Kmen MCM-S byl získán z místních vzorků odebraných v oblasti Muang Chiang Mai v provincii Chiang Mai v Thajsku a je uchováván v entomologické místnosti katedry parazitologie Lékařské fakulty CMU od roku 1995 [39]. Kmen PMD-R, u kterého bylo zjištěno, že je rezistentní vůči permethrinu, byl izolován z polních komárů původně odebraných z Ban Pang Mai Dang v okrese Mae Tang v provincii Chiang Mai v Thajsku a je uchováván ve stejném ústavu od roku 1997 [40]. Kmeny PMD-R byly pěstovány za selektivního tlaku, aby se udržela úroveň rezistence přerušovanou expozicí 0,75% permethrinu za použití detekční soupravy WHO s určitými úpravami [41]. Každý kmen Ae. Aedes aegypti byl kolonizován jednotlivě v laboratoři bez patogenů při teplotě 25 ± 2 °C, relativní vlhkosti 80 ± 10 % a fotoperiodě světlo/tma 14:10 hodin. Přibližně 200 larev bylo chováno v plastových miskách (33 cm dlouhé, 28 cm široké a 9 cm vysoké) naplněných vodou z vodovodu v hustotě 150–200 larev na misku a krmeno dvakrát denně sterilizovanými psími sušenkami. Dospělí červi byli chováni ve vlhkých klecích a kontinuálně krmeni 10% vodným roztokem sacharózy a 10% roztokem multivitaminového sirupu. Samice komárů pravidelně sají krev pro kladení vajíček. Samice staré dva až pět dní, které nebyly krmeny krví, lze kontinuálně používat v experimentálních biologických testech na dospělých jedincích.
Biotest závislosti dávky a mortality na EO byl proveden na dospělých samicích komárů rodu Aedes. aegypti, MCM-S a PMD-R za použití topické metody upravené podle standardního protokolu WHO pro testování citlivosti [42]. EO z každé rostliny byl sériově ředěn vhodným rozpouštědlem (např. ethanolem nebo acetonem), čímž se získala odstupňovaná série 4–6 koncentrací. Po anestezii oxidem uhličitým (CO2) byli komáři jednotlivě zváženi. Anestetizovaní komáři byli poté udržováni nehybně na suchém filtračním papíru na speciální chladicí plotně pod stereomikroskopem, aby se zabránilo jejich reaktivaci během procedury. Pro každé ošetření bylo na horní pronotum samičky aplikováno 0,1 μl roztoku EO pomocí ručního mikrodávkovače Hamilton (700 Series Microliter™, Hamilton Company, Reno, NV, USA). Dvacet pět samic bylo ošetřeno každou koncentrací, s mortalitou v rozmezí od 10 % do 95 % pro alespoň 4 různé koncentrace. Komáři ošetření rozpouštědlem sloužili jako kontrola. Aby se zabránilo kontaminaci testovaných vzorků, vyměňte filtrační papír za nový filtrační papír pro každý testovaný EO. Dávky použité v těchto biologických testech jsou vyjádřeny v mikrogramech EO na miligram živé tělesné hmotnosti samice. Aktivita PBO u dospělých jedinců byla také hodnocena podobným způsobem jako u EO, přičemž PBO byl použit jako pozitivní kontrola v synergických experimentech. Ošetření komáři ve všech skupinách byli umístěni do plastových kelímků a podáno jim bylo 10% sacharóza plus 10% multivitaminový sirup. Všechny biologické testy byly provedeny při teplotě 25 ± 2 °C a relativní vlhkosti 80 ± 10 % a čtyřikrát opakovány s kontrolami. Úmrtnost během 24hodinového období odchovu byla kontrolována a potvrzena absencí reakce komára na mechanickou stimulaci a poté zaznamenána na základě průměru ze čtyř opakování. Experimentální ošetření byla pro každý testovaný vzorek opakována čtyřikrát s použitím různých šarží komárů. Výsledky byly shrnuty a použity k výpočtu procentuální úmrtnosti, která byla použita ke stanovení 24hodinové letální dávky probitovou analýzou.
Synergický anticidní účinek EO a permethrinu byl hodnocen pomocí postupu lokální toxicity [42], jak bylo popsáno dříve. Pro přípravu permethrinu v požadované koncentraci byl použit aceton nebo ethanol jako rozpouštědlo, stejně jako binární směs EO a permethrinu (EO-permethrin: permethrin smíchaný s EO v koncentraci LD25). Testovací soupravy (permethrin a EO-permethrin) byly hodnoceny proti kmenům MCM-S a PMD-R Ae. Aedes aegypti. Každé z 25 samiček komárů byly podány čtyři dávky permethrinu, aby se otestovala jeho účinnost při hubení dospělců, přičemž každé ošetření bylo čtyřikrát opakováno. Pro identifikaci kandidátních synergistů EO bylo každé z 25 samiček komárů podáno 4 až 6 dávek EO-permethrinu, přičemž každá aplikace byla čtyřikrát opakována. Ošetření PBO-permethrinem (permethrin smíchaný s koncentrací PBO LD25) sloužilo také jako pozitivní kontrola. Dávky použité v těchto biologických testech jsou vyjádřeny v nanogramech testovaného vzorku na miligram živé tělesné hmotnosti samice. Pro každý kmen komárů byla provedena čtyři experimentální hodnocení na jednotlivě chovaných šaržích a údaje o úmrtnosti byly shromážděny a analyzovány pomocí programu Probit za účelem stanovení 24hodinové letální dávky.
Míra úmrtnosti byla upravena pomocí Abbottova vzorce [43]. Upravená data byla analyzována regresní analýzou Probit s použitím počítačového statistického programu SPSS (verze 19.0). Letální hodnoty 25 %, 50 %, 90 %, 95 % a 99 % (LD25, LD50, LD90, LD95 a LD99) byly vypočteny s použitím odpovídajících 95% intervalů spolehlivosti (95% CI). Měření významnosti a rozdíly mezi testovanými vzorky byly hodnoceny pomocí chí-kvadrát testu nebo Mann-Whitneyho U testu v rámci každého biologického testu. Výsledky byly považovány za statisticky významné při P< 0,05. Koeficient odporu (RR) se odhaduje na úrovni LD50 pomocí následujícího vzorce [12]:
RR > 1 označuje rezistenci a RR ≤ 1 označuje citlivost. Hodnota synergického poměru (SR) každého kandidáta na synergickou látku se vypočítá následovně [34, 35, 44]:
Tento faktor rozděluje výsledky do tří kategorií: hodnota SR 1±0,05 se považuje za hodnotu bez zjevného účinku, hodnota SR >1,05 se považuje za hodnotu SR se synergickým účinkem a hodnota SR. Světle žlutý kapalný olej lze získat parní destilací oddenků C. rotundus a A. galanga a kůry C. verum. Výtěžky vypočítané na suchou hmotnost byly 0,15 %, 0,27 % (hmotn./hmotn.) a 0,54 % (obj./obj.) (tabulka 1). Studie chemického složení olejů z C. rotundus, A. galanga a C. verum metodou GC-MS ukázala přítomnost 19, 17 a 21 sloučenin, které představovaly 80,22 %, 86,75 % a 97,24 % všech složek (tabulka 2). Sloučeniny oddenkového oleje z C. lucidum se skládají hlavně z cyperonenu (14,04 %), následovaného karalenem (9,57 %), α-kapselanem (7,97 %) a α-kapselanem (7,53 %). Hlavní chemickou složkou oddenkového oleje z galangalu je β-bisabolen (18,27 %), následovaný α-bergamotenem (16,28 %), 1,8-cineolem (10,17 %) a piperonolem (10,09 %). Zatímco cinnamaldehyd (64,66 %) byl identifikován jako hlavní složka oleje z kůry C. verum, octan skořicový (6,61 %), α-kopanen (5,83 %) a 3-fenylpropionaldehyd (4,09 %) byly považovány za vedlejší složky. Chemické struktury cypernu, β-bisabolenu a cinnamaldehydu jsou hlavními sloučeninami C. rotundus, A. galanga a C. verum, jak je znázorněno na obrázku 2.
Výsledky tří OO hodnotících aktivitu u dospělých jedinců proti komárům rodu Aedes. komáry rodu Aedes aegypti jsou uvedeny v tabulce 3. Bylo zjištěno, že všechny EO mají letální účinky na komáry rodu MCM-S Aedes v různých typech a dávkách. Nejúčinnějším EO je C. verum, následovaný A. galanga a C. rotundus s hodnotami LD50 3,30, 7,97 a 10,05 μg/mg u samic MCM-S, což je mírně více než 3,22 (U = 1), Z = -0,775, P = 0,667), 7,94 (U = 2, Z = 0, P = 1) a 9,57 (U = 0, Z = -1,549, P = 0,333) μg/mg PMD-R u žen. To odpovídá tomu, že PBO má mírně vyšší účinek na dospělé jedince na PMD-R než kmen MSM-S, s hodnotami LD50 4,79 a 6,30 μg/mg u samic (U = 0, Z = -2,021, P = 0,057). Lze vypočítat, že hodnoty LD50 C. verum, A. galanga, C. rotundus a PBO proti PMD-R jsou přibližně 0,98, 0,99, 0,95 a 0,76krát nižší než proti MCM-S. To tedy naznačuje, že citlivost na PBO a EO je u obou kmenů Aedes relativně podobná. Ačkoli byl PMD-R citlivější než MCM-S, citlivost Aedes aegypti nebyla významná. Naproti tomu se oba kmeny Aedes značně lišily v citlivosti na permethrin aegypti (tabulka 4). PMD-R prokázal významnou rezistenci vůči permethrinu (hodnota LD50 = 0,44 ng/mg u žen) s vyšší hodnotou LD50 3,70 ve srovnání s MCM-S (hodnota LD50 = 0,44 ng/mg u žen) ng/mg u žen (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Ačkoli je PMD-R mnohem méně citlivý na permethrin než MCM-S, jeho citlivost na PBO a oleje z C. verum, A. galanga a C. rotundus je mírně vyšší než u MCM-S.
Jak bylo pozorováno v biotestu kombinace EO a permethrinu na dospělé populaci, binární směsi permethrinu a EO (LD25) vykazovaly buď synergii (hodnota SR > 1,05), nebo žádný účinek (hodnota SR = 1 ± 0,05). Komplexní účinky směsi EO a permethrinu na dospělé jedince experimentálních albínských komárů. Kmeny Aedes aegypti MCM-S a PMD-R jsou uvedeny v tabulce 4 a na obrázku 3. Bylo zjištěno, že přidání oleje z C. verum mírně snižuje LD50 permethrinu proti MCM-S a mírně zvyšuje LD50 proti PMD-R na 0,44–0,42 ng/mg u žen a z 3,70 na 3,85 ng/mg u žen. Naproti tomu přidání olejů z C. rotundus a A. galanga významně snížilo LD50 permethrinu na MCM-S z 0,44 na 0,07 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) a na 0,11 (U = 0). (Z) = -2,309, P = 0,029) ng/mg u žen. Na základě hodnot LD50 MCM-S byly hodnoty SR směsi EO-permethrinu po přidání olejů z C. rotundus a A. galanga 6,28, respektive 4,00. V souladu s tím se LD50 permethrinu proti PMD-R významně snížila z 3,70 na 0,42 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) a na 0,003 s přidáním olejů z C. rotundus a A. galanga (U = 0, Z = -2,337, P = 0,029) ng/mg samice. Hodnota SR permethrinu v kombinaci s C. rotundus proti PMD-R byla 8,81, zatímco hodnota SR směsi galangalu a permethrinu byla 1233,33. V porovnání s MCM-S se hodnota LD50 pozitivní kontroly PBO snížila z 0,44 na 0,26 ng/mg (samice) a z 3,70 ng/mg (samice) na 0,65 ng/mg (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) a PMD-R (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Hodnoty SR směsi PBO a permethrinu pro kmeny MCM-S a PMD-R byly 1,69, respektive 5,69. Tyto výsledky naznačují, že oleje z C. rotundus a A. galanga a PBO zvyšují toxicitu permethrinu ve větší míře než olej z C. verum u kmenů MCM-S a PMD-R.
Aktivita EO, PBO, permethrinu (PE) a jejich kombinací v dospělosti (LD50) proti kmenům komárů Aedes citlivým na pyrethroid (MCM-S) a rezistentním (PMD-R) kmenům komárů Aedes. Aedes aegypti
[45]. Syntetické pyrethroidy se používají po celém světě k hubení téměř všech členovců zemědělského a lékařského významu. Vzhledem ke škodlivým důsledkům používání syntetických insekticidů, zejména pokud jde o vývoj a širokou rezistenci komárů, a také o dopad na dlouhodobé zdraví a životní prostředí, je nyní naléhavě nutné omezit používání tradičních syntetických insekticidů a vyvinout alternativy [35, 46, 47]. Kromě ochrany životního prostředí a lidského zdraví patří mezi výhody botanických insekticidů vysoká selektivita, globální dostupnost a snadná výroba a použití, což je činí atraktivnějšími pro hubení komárů [32, 48, 49]. Tato studie kromě objasnění chemických vlastností účinných esenciálních olejů pomocí GC-MS analýzy také posoudila účinnost dospělých esenciálních olejů a jejich schopnost zvyšovat toxicitu syntetického permethrinu *aegypti* u kmenů citlivých na pyrethroidy (MCM-S) a rezistentních kmenů (PMD-R).
Charakterizace GC-MS ukázala, že cyperen (14,04 %), β-bisabolen (18,27 %) a cinnamaldehyd (64,66 %) byly hlavními složkami olejů z C. rotundus, A. galanga a C. verum. Tyto chemikálie prokázaly rozmanité biologické účinky. Ahn a kol. [50] uvedli, že 6-acetoxycyperen, izolovaný z oddenku C. rotundus, působí jako protinádorová sloučenina a může indukovat apoptózu závislou na kaspázách v buňkách rakoviny vaječníků. β-Bisabolen, extrahovaný z esenciálního oleje myrhovníku, vykazuje specifickou cytotoxicitu proti lidským a myším nádorovým buňkám mléčné žlázy in vitro i in vivo [51]. Bylo zjištěno, že cinnamaldehyd, získaný z přírodních extraktů nebo syntetizovaný v laboratoři, má insekticidní, antibakteriální, antifungální, protizánětlivé, imunomodulační, protinádorové a antiangiogenní účinky [52].
Výsledky biologického testu aktivity u dospělých jedinců závislé na dávce ukázaly dobrý potenciál testovaných EO a ukázaly, že kmeny komárů Aedes MCM-S a PMD-R měly podobnou citlivost na EO a PBO. Aedes aegypti. Srovnání účinnosti EO a permethrinu ukázalo, že druhý jmenovaný má silnější alergický účinek: hodnoty LD50 jsou 0,44 a 3,70 ng/mg u samic kmenů MCM-S a PMD-R. Tato zjištění jsou podpořena mnoha studiemi, které ukazují, že přirozeně se vyskytující pesticidy, zejména produkty rostlinného původu, jsou obecně méně účinné než syntetické látky [31, 34, 35, 53, 54]. To může být způsobeno tím, že první z nich je komplexní kombinací aktivních nebo neaktivních složek, zatímco druhý je purifikovanou samostatnou aktivní sloučeninou. Rozmanitost a komplexnost přírodních aktivních složek s různými mechanismy účinku však může zvýšit biologickou aktivitu nebo bránit rozvoji rezistence v hostitelských populacích [55, 56, 57]. Mnoho výzkumníků informovalo o protikomárím potenciálu C. verum, A. galanga a C. rotundus a jejich složek, jako je β-bisabolen, cinnamaldehyd a 1,8-cineol [22, 36, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64]. Přehled literatury však ukázal, že neexistují žádné předchozí zprávy o jeho synergickém účinku s permethrinem nebo jinými syntetickými insekticidy proti komárům rodu Aedes. Aedes aegypti.
V této studii byly pozorovány významné rozdíly v citlivosti na permethrin mezi dvěma kmeny Aedes. Aedes aegypti. MCM-S je citlivý na permethrin, zatímco PMD-R je na něj mnohem méně citlivý, s mírou rezistence 8,41. Ve srovnání s citlivostí MCM-S je PMD-R méně citlivý na permethrin, ale citlivější na EO, což poskytuje základ pro další studie zaměřené na zvýšení účinnosti permethrinu jeho kombinací s EO. Synergický kombinovaný biologický test účinků na dospělé jedince ukázal, že binární směsi EO a permethrinu snižují nebo zvyšují úmrtnost dospělých Aedes. Aedes aegypti. Přidání oleje z C. verum mírně snížilo LD50 permethrinu proti MCM-S, ale mírně zvýšilo LD50 proti PMD-R s hodnotami SR 1,05 a 0,96. To naznačuje, že olej z C. verum nemá synergický ani antagonistický účinek na permethrin při testování na MCM-S a PMD-R. Naproti tomu oleje z C. rotundus a A. galanga vykazovaly významný synergický efekt tím, že významně snížily hodnoty LD50 permethrinu na MCM-S nebo PMD-R. Pokud byl permethrin kombinován s EO z C. rotundus a A. galanga, hodnoty SR směsi EO-permethrin pro MCM-S byly 6,28, respektive 4,00. Navíc, když byl permethrin hodnocen proti PMD-R v kombinaci s C. rotundus (SR = 8,81) nebo A. galanga (SR = 1233,33), hodnoty SR se významně zvýšily. Za zmínku stojí, že jak C. rotundus, tak A. galanga významně zvýšily toxicitu permethrinu proti PMD-R Ae. aegypti. Podobně bylo zjištěno, že PBO zvyšuje toxicitu permethrinu s hodnotami SR 1,69, respektive 5,69 pro kmeny MCM-S a PMD-R. Vzhledem k tomu, že C. rotundus a A. galanga měly nejvyšší hodnoty SR, byly považovány za nejlepší synergisty při zvyšování toxicity permethrinu na MCM-S a PMD-R.
Několik předchozích studií uvádělo synergický účinek kombinací syntetických insekticidů a rostlinných extraktů proti různým druhům komárů. Larvicidní biologický test proti komáru rodu Anopheles Stephensi, který studovali Kalayanasundaram a Das [65], ukázal, že fenthion, širokospektrální organofosfát, byl asociován s komáry rodu Cleodendron inerme, Pedalium murax a Parthenium hysterophorus. Mezi extrakty byla pozorována významná synergie se synergickým účinkem (SF) 1,31, 1,38, 1,40, 1,48, 1,61 a 2,23. V larvicidní screeningové studii 15 druhů mangrovových porostů se ukázalo, že petroletherový extrakt z chocholatých kořenů mangrovových porostů je nejúčinnější proti komárovi rodu Culex quinquefasciatus s hodnotou LC50 25,7 mg/l [66]. Synergický účinek tohoto extraktu a botanického insekticidu pyrethrin byl také hlášen ke snížení LC50 pyrethrinu proti larvám C. quinquefasciatus z 0,132 mg/l na 0,107 mg/l, navíc byl v této studii použit výpočet SF 1,23. 34,35,44]. Byla hodnocena kombinovaná účinnost extraktu z kořene Solanum citron a několika syntetických insekticidů (např. fenthion, cypermethrin (syntetický pyretroid) a timethfos (organofosforový larvicid)) proti komárům rodu Anopheles. Stephensi [54] a C. quinquefasciatus [34]. Kombinované použití cypermethrinu a petroletherového extraktu ze žlutých plodů prokázalo synergický účinek na cypermethrin ve všech poměrech. Nejúčinnějším poměrem byla binární kombinace 1:1 s hodnotami LC50 a SF 0,0054 ppm a 6,83 v porovnání s An. Stephen West[54]. Zatímco binární směs S. xanthocarpum a temefosu v poměru 1:1 byla antagonistická (SF = 0,6406), kombinace S. xanthocarpum-fenthion (1:1) vykazovala synergickou aktivitu proti C. quinquefasciatus s SF 1,3125 [34]]. Tong a Blomquist [35] studovali účinky rostlinného ethylenoxidu na toxicitu karbarylu (širokospektrální karbamát) a permethrinu pro komáry rodu Aedes. Aedes aegypti. Výsledky ukázaly, že ethylenoxid z agaru, černého pepře, jalovce, smile, santalového dřeva a sezamu zvýšil toxicitu karbarylu pro komáry rodu Aedes. Hodnoty SR larev rodu Aegypti se pohybují od 1,0 do 7,0. Naproti tomu žádný z EO nebyl toxický pro dospělé komáry rodu Aedes. V této fázi nebyly hlášeny žádné synergické účinky kombinace Aedes aegypti a EO-karbarylu. PBO byl použit jako pozitivní kontrola ke zvýšení toxicity karbarylu proti komárům Aedes. Hodnoty SR larev a dospělců Aedes aegypti jsou 4,9-9,5 a 2,3. Na larvicidní aktivitu byly testovány pouze binární směsi permethrinu a EO nebo PBO. Směs EO-permethrinu měla antagonistický účinek, zatímco směs PBO-permethrinu měla synergický účinek proti komárům Aedes. Larvy Aedes aegypti. Experimenty s dávkovou odezvou a hodnocení SR pro směsi PBO-permethrinu však dosud nebyly provedeny. Ačkoli bylo dosaženo jen málo výsledků ohledně synergických účinků fytosyntetických kombinací proti přenašečům komárů, tato data podporují stávající výsledky, které otevírají možnost přidání synergistů nejen ke snížení aplikované dávky, ale také ke zvýšení účinku hubení hmyzu. Účinnost hmyzu. Výsledky této studie navíc poprvé prokázaly, že oleje z C. rotundus a A. galanga synergicky vykazují významně vyšší účinnost proti kmenům komárů Aedes citlivým a rezistentním na pyretroidy ve srovnání s PBO, pokud jsou kombinovány s toxicitou permethrinu. Aedes aegypti. Neočekávané výsledky synergické analýzy však ukázaly, že olej z C. verum měl největší antidospělou aktivitu proti oběma kmenům Aedes. Toxický účinek permethrinu na Aedes aegypti byl překvapivě neuspokojivý. Rozdíly v toxických a synergických účincích mohou být částečně způsobeny expozicí různým typům a hladinám bioaktivních složek v těchto olejích.
Navzdory snahám o pochopení, jak zlepšit účinnost, zůstávají synergické mechanismy nejasné. Mezi možné důvody rozdílné účinnosti a synergického potenciálu mohou patřit rozdíly v chemickém složení testovaných produktů a rozdíly v náchylnosti k komárům spojené se stavem rezistence a vývojem. Mezi hlavními a vedlejšími složkami ethylenoxidu testovanými v této studii existují rozdíly a některé z těchto sloučenin prokázaly repelentní a toxické účinky proti různým škůdcům a přenašečům chorob [61,62,64,67,68]. Hlavní sloučeniny charakterizované v olejích z C. rotundus, A. galanga a C. verum, jako je cypern, β-bisabolen a cinnamaldehyd, však v této práci nebyly testovány na jejich antidospělé a synergické účinky proti Ae. Aedes aegypti. Proto jsou zapotřebí další studie, které by izolovaly aktivní složky přítomné v každém esenciálním oleji a objasnily jejich insekticidní účinnost a synergické interakce proti tomuto přenašeči komárů. Insekticidní aktivita obecně závisí na působení a reakci mezi jedy a hmyzími tkáněmi, což lze zjednodušeně rozdělit do tří fází: penetrace do kůže těla hmyzu a membrán cílových orgánů, aktivace (= interakce s cílem) a detoxikace toxických látek [57, 69]. Synergismus insekticidů, který vede ke zvýšené účinnosti kombinací toxických látek, proto vyžaduje alespoň jednu z těchto kategorií, jako je zvýšená penetrace, větší aktivace nahromaděných sloučenin nebo menší snížení detoxikace účinné látky pesticidu. Například energetická tolerance zpožďuje penetraci kutikuly skrz ztluštělou kutikulu a biochemickou rezistenci, jako je zvýšený metabolismus insekticidů pozorovaný u některých rezistentních kmenů hmyzu [70, 71]. Významná účinnost etylenoxidů (EO) při zvyšování toxicity permethrinu, zejména proti PMD-R, může naznačovat řešení problému rezistence na insekticidy interakcí s mechanismy rezistence [57, 69, 70, 71]. Tong a Blomquist [35] podpořili výsledky této studie prokázáním synergické interakce mezi EO a syntetickými pesticidy. aegypti existují důkazy o inhibiční aktivitě proti detoxikačním enzymům, včetně cytochrom P450 monooxygenáz a karboxylesteráz, které úzce souvisejí s rozvojem rezistence vůči tradičním pesticidům. PBO je nejen metabolickým inhibitorem cytochrom P450 monooxygenázy, ale také zlepšuje penetraci insekticidů, jak prokázalo jeho použití jako pozitivní kontroly v synergických studiích [35, 72]. Je zajímavé, že 1,8-cineol, jedna z důležitých složek obsažených v galangalovém oleji, je známý svými toxickými účinky na druhy hmyzu [22, 63, 73] a bylo hlášeno, že má synergické účinky v několika oblastech výzkumu biologické aktivity [74]. ,75,76,77]. Kromě toho má 1,8-cineol v kombinaci s různými léčivy, včetně kurkuminu [78], 5-fluorouracilu [79], kyseliny mefenamové [80] a zidovudinu [81], také účinek podporující permeaci in vitro. Možná role 1,8-cineolu v synergickém insekticidním účinku tedy nespočívá pouze v jeho působení jako aktivní složky, ale také v jeho působení jako zesilovače penetrace. Vzhledem k většímu synergismu s permethrinem, zejména proti PMD-R, mohou synergické účinky galangalového oleje a trichosanthesového oleje pozorované v této studii vyplývat z interakcí s mechanismy rezistence, tj. zvýšené propustnosti pro chlór. Pyrethroidy zvyšují aktivaci nahromaděných sloučenin a inhibují detoxikační enzymy, jako jsou cytochrom P450 monooxygenázy a karboxylesterázy. Tyto aspekty však vyžadují další studium, aby se objasnila specifická role EO a jeho izolovaných sloučenin (samostatně nebo v kombinaci) v synergických mechanismech.
V roce 1977 byly v Thajsku hlášeny rostoucí úrovně rezistence na permethrin u hlavních populací přenašečů a v následujících desetiletích bylo používání permethrinu z velké části nahrazeno jinými pyrethroidními chemikáliemi, zejména těmi, které byly nahrazeny deltamethinem [82]. Rezistence přenašečů na deltamethrin a další třídy insekticidů je však v celé zemi extrémně běžná kvůli nadměrnému a trvalému používání [14, 17, 83, 84, 85, 86]. Pro boj s tímto problémem se doporučuje střídat nebo znovu používat vyřazené pesticidy, které byly dříve účinné a méně toxické pro savce, jako je permethrin. V současné době, ačkoli bylo používání permethrinu v nedávných národních vládních programech na hubení komárů sníženo, lze v populacích komárů stále nalézt rezistenci na permethrin. To může být způsobeno vystavením komárů komerčním domácím produktům na hubení škůdců, které se skládají převážně z permethrinu a dalších pyrethroidů [14, 17]. Úspěšné opětovné využití permethrinu proto vyžaduje vývoj a implementaci strategií ke snížení rezistence přenašečů. Ačkoli žádný z esenciálních olejů testovaných v této studii jednotlivě nebyl tak účinný jako permethrin, jejich společné působení s permethrinem vedlo k působivým synergickým účinkům. To je slibný signál, že interakce EO s mechanismy rezistence vede k tomu, že kombinace permethrinu s EO je účinnější než insekticid nebo EO samotný, zejména proti PMD-R Ae. Aedes aegypti. Výhody synergických směsí ve zvýšení účinnosti, i přes použití nižších dávek pro kontrolu vektorů, mohou vést ke zlepšení léčby rezistence a snížení nákladů [33, 87]. Z těchto výsledků je potěšující konstatovat, že EO z A. galanga a C. rotundus byly významně účinnější než PBO v synergickém účinku toxicity permethrinu u kmenů MCM-S i PMD-R a představují potenciální alternativu k tradičním ergogenním pomůckám.
Vybrané etylénoxidy (EO) měly významné synergické účinky při zvyšování toxicity u dospělých jedinců proti PMD-R Ae. aegypti, zejména galangalový olej s hodnotou SR až 1233,33, což naznačuje, že EO má široký potenciál jako synergista při zvyšování účinnosti permethrinu. To může stimulovat použití nového aktivního přírodního produktu, který by společně mohl zvýšit používání vysoce účinných produktů pro hubení komárů. Odhaluje to také potenciál ethylenoxidu jako alternativního synergista pro efektivní zlepšení starších nebo tradičních insekticidů s cílem řešit stávající problémy s rezistencí v populacích komárů. Používání snadno dostupných rostlin v programech hubení komárů nejen snižuje závislost na dovážených a drahých materiálech, ale také stimuluje místní úsilí o posílení systémů veřejného zdraví.
Tyto výsledky jasně ukazují významný synergický efekt, který vytváří kombinace ethylenoxidu a permethrinu. Výsledky zdůrazňují potenciál ethylenoxidu jako rostlinného synergistu v hubení komárů, který zvyšuje účinnost permethrinu proti komárům, zejména v rezistentních populacích. Budoucí vývoj a výzkum budou vyžadovat synergickou bioanalýzu olejů z galangalu a alpínie a jejich izolovaných sloučenin, kombinace insekticidů přírodního nebo syntetického původu proti více druhům a stádiím komárů a testování toxicity proti necílovým organismům. Praktické využití ethylenoxidu jako životaschopného alternativního synergistu.
Světová zdravotnická organizace. Globální strategie pro prevenci a kontrolu horečky dengue 2012–2020. Ženeva: Světová zdravotnická organizace, 2012.
Weaver SC, Costa F., Garcia-Blanco MA, Ko AI, Ribeiro GS, Saade G. a kol. Virus Zika: historie, vznik, biologie a vyhlídky kontroly. Antivirový výzkum. 2016;130:69–80.
Světová zdravotnická organizace. Informační list o horečce dengue. 2016. http://www.searo.who.int/entity/vector_borne_tropical_diseases/data/data_factsheet/en/. Datum přístupu: 20. ledna 2017
Ministerstvo veřejného zdraví. Aktuální stav případů horečky dengue a hemoragické horečky dengue v Thajsku. 2016. http://www.m-society.go.th/article_attach/13996/17856.pdf. Datum přístupu: 6. ledna 2017
Ooi EE, Goh CT, Gabler DJ. 35 let prevence horečky dengue a kontroly vektorů v Singapuru. Náhlé infekční onemocnění. 2006;12:887–93.
Morrison AC, Zielinski-Gutierrez E, Scott TW, Rosenberg R. Identifikace problémů a návrh řešení pro kontrolu virových přenašečů Aedes aegypti. PLOS Medicine. 2008;5:362–6.
Centra pro kontrolu a prevenci nemocí. Horečka dengue, entomologie a ekologie. 2016. http://www.cdc.gov/dengue/entomologyecology/. Datum přístupu: 6. ledna 2017
Ohimain EI, Angaye TKN, Bassey SE. Srovnání larvicidní aktivity listů, kůry, stonků a kořenů rostliny Jatropa curcas (Euphorbiaceae) proti přenašeči malárie Anopheles gambiae. SZhBR. 2014;3:29-32.
Soleimani-Ahmadi M, Watandoust H, Zareh M. Charakteristika biotopů larev Anopheles v oblastech s malárií v rámci programu eradikace malárie v jihovýchodním Íránu. Asia Pacific J Trop Biomed. 2014;4(Suppl 1):S73–80.
Bellini R, Zeller H, Van Bortel W. Přehled přístupů k regulaci vektorů, prevenci a kontrole ohnisek viru západního Nilu a výzvy, kterým čelí Evropa. Paraziti jako vektor. 2014;7:323.
Muthusamy R., Shivakumar MS Selekce a molekulární mechanismy rezistence na cypermethrin u housenek červených (Amsacta albistriga Walker). Biochemická fyziologie škůdců. 2014;117:54–61.
Ramkumar G., Shivakumar MS Laboratorní studie rezistence na permethrin a zkřížené rezistence Culex quinquefasciatus vůči jiným insekticidům. Palastor Research Center. 2015;114:2553–60.
Matsunaka S, Hutson DH, Murphy SD. Chemie pesticidů: Human Welfare and the Environment, sv. 3: Mechanismus účinku, metabolismus a toxikologie. New York: Pergamon Press, 1983.
Chareonviriyaphap T, Bangs MJ, Souvonkert V, Kongmi M, Korbel AV, Ngoen-Klan R. Přehled rezistence vůči insekticidům a behaviorálního vyhýbání se lidským přenašečům nemocí v Thajsku. Paraziti - přenašeči. 2013;6:280.
Chareonviriyaphap T, Aum-Aung B, Ratanatham S. Současné vzorce rezistence na insekticidy u komárů přenašečů v Thajsku. Southeast Asia J Trop Med Public Health. 1999;30:184-94.
Chareonviriyaphap T, Bangs MJ, Ratanatham S. Stav malárie v Thajsku. Southeast Asia J Trop Med Public Health. 2000;31:225–37.
Plernsub S, Saingamsuk J, Yanola J, Lumjuan N, Thippavankosol P, Walton S, Somboon P. Časová frekvence mutací F1534C a V1016G způsobujících rezistenci vůči komárům Aedes aegypti v Chiang Mai v Thajsku a dopad mutací na účinnost termálních mlhových sprejů obsahujících pyrethroidy. Aktatrop. 2016;162:125–32.
Vontas J, Kioulos E, Pavlidi N, Moru E, Della Torre A, Ranson H. Rezistence na insekticidy u hlavních vektorů horečky dengue Aedes albopictus a Aedes aegypti. Biochemická fyziologie škůdců. 2012;104:126–31.
Čas zveřejnění: 8. července 2024