Antihelmintikum N,N-diethyl-m-toluamid (DEET) bylo hlášeno, že inhibuje AChE (acetylcholinesterázu) a má potenciální karcinogenní vlastnosti v důsledku nadměrné vaskularizace. V tomto článku ukazujeme, že DEET specificky stimuluje endoteliální buňky, které podporují angiogenezi, a tím zvyšují růst nádoru. DEET aktivuje buněčné procesy vedoucí k angiogenezi, včetně proliferace, migrace a adheze. To je spojeno se zvýšenou produkcí NO a expresí VEGF v endoteliálních buňkách. Umlčení M3 nebo použití farmakologických M3 inhibitorů odstranilo všechny tyto účinky, což naznačuje, že DEET-indukovaná angiogeneze je M3-senzitivní. Experimenty zahrnující kalciovou signalizaci v endoteliálních a HEK buňkách nadměrně exprimujících M3 receptory, stejně jako vazebné a dokovací studie naznačují, že DEET působí jako alosterický modulátor M3 receptorů. DEET dále inhibuje AChE, čímž zvyšuje biologickou dostupnost acetylcholinu a jeho vazbu na M3 receptory a zesiluje proangiogenní účinky prostřednictvím alosterické regulace.
Primární EC byly izolovány z aorty švýcarských myší. Metoda extrakce byla upravena z protokolu Kobayashi26. Myší EC byly kultivovány v médiu EBM-2 doplněném 5% teplem inaktivovaným FBS až do čtvrté pasáže.
Účinek dvou koncentrací DEET na proliferaci HUVEC, U87MG nebo BF16F10 byl analyzován pomocí CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Stručně, 5,103 buněk na jamku bylo nasazeno na 96-jamkovou destičku, ponecháno se přes noc uchytit a poté ošetřeno DEET po dobu 24 hodin. Po odstranění růstového média přidejte roztok vázající barvivo do každé jamky mikrodestičky a inkubujte buňky při 37 °C po dobu 30 minut. Hladiny fluorescence byly stanoveny pomocí multimódové čtečky mikrodestiček Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Německo) vybavené 485 nm excitačními filtry a 530 nm emisními filtry.
HUVEC byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 104 buněk na jamku. Buňky byly ošetřeny DEET po dobu 24 hodin. Životaschopnost buněk byla hodnocena pomocí kolorimetrického testu MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Hodnoty optické hustoty byly získány na multimódové čtečce mikrodestiček (Mithras LB940) při vlnové délce 570 nm.
Účinky DEET byly studovány pomocí in vitro testů angiogeneze. Léčba pomocí 10-8 M nebo 10-5 M DEET zvýšila tvorbu délky kapilár v HUVEC (obr. 1a, b, bílé sloupce). Ve srovnání s kontrolní skupinou léčba koncentracemi DEET v rozmezí od 10-14 do 10-5 M ukázala, že délka kapiláry dosáhla plató při 10-8 M DEET (doplňkový obr. S2). Nebyl nalezen žádný významný rozdíl v in vitro proangiogenním účinku HUVEC ošetřených DEET v koncentračním rozmezí 10-8 M a 10-5 M.
Abychom určili účinek DEET na neovaskularizaci, provedli jsme in vivo neovaskularizační studie. Po 14 dnech myši, kterým byly injikovány endoteliální buňky předkultivované s 10-8 M nebo 10-5 M DEET, vykazovaly významné zvýšení obsahu hemoglobinu (obr. 1c, bílé sloupce).
Kromě toho byla neovaskularizace indukovaná DEET studována u myší s xenoimplantátem U87MG, kterým byl denně (ip) injikován DEET v dávce, o které je známo, že indukuje plazmatické koncentrace 10-5 M, což je normální u exponovaných lidí. u 23. Detekovatelné nádory (tj. nádory >100 mm3) byly pozorovány 14 dní po injekci buněk U87MG myším. V den 28 byl růst nádoru významně zvýšen u myší léčených DEET ve srovnání s kontrolními myšmi (obr. 1d, čtverce). Kromě toho barvení nádorů CD31 ukázalo, že DEET významně zvýšil kapilární oblast, ale ne hustotu mikrocév. (obr. 1e–g).
Ke stanovení role muskarinových receptorů v DETA-indukované proliferaci bylo použito 10-8 M nebo 10-5 M DETA v přítomnosti pFHHSiD (10-7 M, selektivní antagonista M3 receptoru). Léčba HUVEC. pFHHSiD zcela blokoval proliferační vlastnosti DETA ve všech koncentracích (tabulka 1).
Za těchto podmínek jsme také zkoumali, zda DEET zvýší délku kapilár v buňkách HUVEC. Podobně pFHHSiD významně zabránil délce kapilár indukované DEET (obr. 1a, b, šedé sloupce). Kromě toho byly podobné experimenty provedeny s M3 siRNA. Ačkoli kontrolní siRNA nebyla účinná při podpoře tvorby kapilár, umlčení muskarinového receptoru M3 zrušilo schopnost DEET prodlužovat délku kapilár (obr. 1a, b, černé pruhy).
Kromě toho, jak 10-8 M nebo 10-5 M DEET-indukovaná vaskularizace in vitro, tak neovaskularizace in vivo byly zcela blokovány pFHHSiD (obr. lc, d, kroužky). Tyto výsledky naznačují, že DEET podporuje angiogenezi prostřednictvím dráhy citlivé na selektivní antagonisty M3 receptoru nebo M3 siRNA.
AChE je molekulárním cílem DEET. Léky jako donepezil, které působí jako inhibitory AChE, mohou stimulovat EC angiogenezi in vitro a na modelech ischemie zadních končetin myší14. Testovali jsme účinek dvou koncentrací DEET na aktivitu enzymu AChE v HUVEC. Nízké (10-8 M) a vysoké (10-5 M) koncentrace DEET snižovaly endoteliální AChE aktivitu ve srovnání s kontrolními podmínkami (obr. 2).
Obě koncentrace DEET (10-8 M a 10-5 M) snižovaly aktivitu acetylcholinesterázy na HUVEC. BW284c51 (10-5 M) byl použit jako kontrola pro inhibitory acetylcholinesterázy. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento aktivity AChE na HUVEC ošetřených dvěma koncentracemi DEET ve srovnání s buňkami ošetřenými vehikulem. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM ze šesti nezávislých experimentů. *p < 0,05 ve srovnání s kontrolou (Kruskal-Wallisův a Dunnův vícenásobný srovnávací test).
Oxid dusnatý (NO) se účastní angiogenního procesu 33, proto byla studována produkce NO v DEET stimulovaných HUVEC. Endoteliální produkce NO ošetřená DEET byla ve srovnání s kontrolními buňkami zvýšena, ale významnosti dosáhla pouze při dávce 10-8 M (obr. 3c). Pro stanovení molekulárních změn kontrolujících produkci NO indukovanou DEET byla exprese a aktivace eNOS analyzována pomocí Western blotu. Ačkoli léčba DEET nezměnila expresi eNOS, významně zvýšila fosforylaci eNOS v jeho aktivačním místě (Ser-1177) a zároveň snížila jeho inhibiční místo (Thr-495) ve srovnání s neošetřenými buňkami ve fosforylaci eNOS (obr. 3d). Kromě toho byl poměr fosforylované eNOS v aktivačním místě a inhibičním místě vypočítán po normalizaci množství fosforylovaného eNOS k celkovému množství enzymu. Tento poměr byl významně zvýšen u buněk HUVEC ošetřených každou koncentrací DEET ve srovnání s neošetřenými buňkami (obr. 3d).
Nakonec byla pomocí Western blotu analyzována exprese VEGF, jednoho z hlavních proangiogenních faktorů. DEET významně zvýšil expresi VEGF, zatímco pFHHSiD tuto expresi zcela blokoval.
Vzhledem k tomu, že účinky DEET jsou citlivé jak na farmakologickou blokádu, tak na downregulaci M3 receptorů, testovali jsme hypotézu, že DEET může zvýšit vápníkovou signalizaci. Překvapivě DEET nedokázal zvýšit cytoplazmatický vápník v HUVEC (data nejsou uvedena) a HEK/M3 (obr. 4a, b) pro obě použité koncentrace.
Čas odeslání: 30. prosince 2024