Antihelmintikum N,N-diethyl-m-toluamid (DEET) bylo popsáno, že inhibuje AChE (acetylcholinesterázu) a má potenciálně karcinogenní vlastnosti v důsledku nadměrné vaskularizace. V této práci ukazujeme, že DEET specificky stimuluje endotelové buňky, které podporují angiogenezi, a tím zvyšují růst nádoru. DEET aktivuje buněčné procesy vedoucí k angiogenezi, včetně proliferace, migrace a adheze. To je spojeno se zvýšenou produkcí NO a expresí VEGF v endotelových buňkách. Umlčení M3 nebo použití farmakologických inhibitorů M3 všechny tyto účinky zrušilo, což naznačuje, že angiogeneze indukovaná DEET je citlivá na M3. Experimenty zahrnující kalciovou signalizaci v endotelových a HEK buňkách s nadměrnou expresí M3 receptorů, stejně jako studie vazby a dokování, naznačují, že DEET působí jako alosterický modulátor M3 receptorů. DEET dále inhibuje AChE, čímž zvyšuje biologickou dostupnost acetylcholinu a jeho vazbu na M3 receptory a zvyšuje proangiogenní účinky prostřednictvím alosterické regulace.
Primární endotelové buňky (EC) byly izolovány z aorty švýcarských myší. Metoda extrakce byla adaptována z Kobayashiho protokolu26. Myší EC byly kultivovány v médiu EBM-2 doplněném 5 % tepelně inaktivovaného FBS až do čtvrté pasáže.
Vliv dvou koncentrací DEET na proliferaci HUVEC, U87MG nebo BF16F10 byl analyzován pomocí soupravy CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Stručně řečeno, 5.103 buněk na jamku bylo naočkováno do 96jamkové destičky, ponecháno přes noc k přichycení a poté ošetřeno DEET po dobu 24 hodin. Po odstranění růstového média byl do každé jamky mikrotitrační destičky přidán roztok vázající barvivo a buňky inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut. Hladiny fluorescence byly stanoveny pomocí multimódového čtecího přístroje mikrotitračních destiček Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Německo) vybaveného excitačními filtry 485 nm a emisními filtry 530 nm.
HUVEC byly naočkovány do 96jamkových destiček v hustotě 10⁴ buněk na jamku. Buňky byly ošetřeny DEET po dobu 24 hodin. Životaschopnost buněk byla stanovena kolorimetrickým MTT testem (Sigma-Aldrich, M5655). Hodnoty optické hustoty byly získány na multimódovém mikrodestičkovém čtecím přístroji (Mithras LB940) při vlnové délce 570 nm.
Účinky DEET byly studovány pomocí in vitro angiogenních testů. Léčba 10-8 M nebo 10-5 M DEET zvýšila tvorbu kapilár v HUVEC (obr. 1a, b, bílé sloupce). Ve srovnání s kontrolní skupinou ukázala léčba koncentracemi DEET v rozmezí 10-14 až 10-5 M, že délka kapilár dosáhla plató při 10-8 M DEET (doplňkový obr. S2). Nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v proangiogenním účinku HUVEC ošetřených DEET v koncentračním rozmezí 10-8 M a 10-5 M in vitro.
Pro stanovení vlivu DEET na neovaskularizaci jsme provedli in vivo studie neovaskularizace. Po 14 dnech vykazovaly myši injikované endoteliálními buňkami předkultivovanými 10-8 M nebo 10-5 M DEET významný nárůst obsahu hemoglobinu (obr. 1c, bílé sloupce).
Dále byla studována neovaskularizace indukovaná DEET u myší s xenograftem U87MG, kterým byl denně (ip) injikován DEET v dávce, o které je známo, že indukuje plazmatické koncentrace 10-5 M, což je u exponovaných lidí normální. v 23. Detekovatelné nádory (tj. nádory >100 mm3) byly pozorovány 14 dní po injekci buněk U87MG myším. 28. den byl růst nádoru u myší léčených DEET významně zvýšen ve srovnání s kontrolními myšmi (obr. 1d, čtverce). Barvení nádorů pomocí CD31 dále ukázalo, že DEET významně zvýšil plochu kapilár, ale nikoli hustotu mikrocév. (obr. 1e–g).
Pro stanovení role muskarinových receptorů v proliferaci indukované DETA bylo použito 10⁻⁶ M nebo 10⁻⁶ M DETA v přítomnosti pFHHSiD (10⁻⁶ M, selektivní antagonista M3 receptoru). Ošetření HUVEC pomocí pFHHSiD kompletně blokovalo proliferační vlastnosti DETA při všech koncentracích (tabulka 1).
Za těchto podmínek jsme také zkoumali, zda DEET zvyšuje délku kapilár v buňkách HUVEC. Podobně pFHHSiD významně zabránil prodloužení kapilár vyvolanému DEET (obr. 1a, b, šedé sloupce). Podobné experimenty byly provedeny i s M3 siRNA. Ačkoli kontrolní siRNA nebyla účinná v podpoře tvorby kapilár, umlčení muskarinového receptoru M3 zrušilo schopnost DEET zvětšovat délku kapilár (obr. 1a, b, černé sloupce).
Kromě toho byla pFHHSiD kompletně blokována jak 10-8 M, tak 10-5 M DEET-indukovaná vaskularizace in vitro, tak i neovaskularizace in vivo (obr. 1c, d, kruhy). Tyto výsledky naznačují, že DEET podporuje angiogenezi prostřednictvím dráhy citlivé na selektivní antagonisty M3 receptoru nebo M3 siRNA.
AChE je molekulárním cílem DEET. Léky, jako je donepezil, které působí jako inhibitory AChE, mohou stimulovat angiogenezi endoteliálních buněk in vitro a v modelech ischemie zadních končetin u myší14. Testovali jsme vliv dvou koncentrací DEET na aktivitu enzymu AChE v HUVEC. Nízké (10-8 M) a vysoké (10-5 M) koncentrace DEET snížily endoteliální aktivitu AChE ve srovnání s kontrolními podmínkami (obr. 2).
Obě koncentrace DEET (10-8 M a 10-5 M) snížily aktivitu acetylcholinesterázy na buňkách HUVEC. BW284c51 (10-5 M) byl použit jako kontrola pro inhibitory acetylcholinesterázy. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento aktivity AChE na buňkách HUVEC ošetřených těmito dvěma koncentracemi DEET ve srovnání s buňkami ošetřenými vehikulem. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM ze šesti nezávislých experimentů. *p < 0,05 ve srovnání s kontrolou (test vícenásobného srovnání Kruskala-Wallise a Dunna).
Oxid dusnatý (NO) se podílí na angiogenním procesu 33, proto byla studována produkce NO v HUVEC stimulovaných DEET. Produkce endoteliálního NO ošetřená DEET byla ve srovnání s kontrolními buňkami zvýšena, ale dosáhla významnosti pouze při dávce 10-8 M (obr. 3c). Pro stanovení molekulárních změn řídících produkci NO indukovanou DEET byla exprese a aktivace eNOS analyzována Western blottingem. Ačkoli ošetření DEET nezměnilo expresi eNOS, významně zvýšilo fosforylaci eNOS v jeho aktivačním místě (Ser-1177) a zároveň snížilo jeho inhibiční místo (Thr-495) ve srovnání s neošetřenými buňkami při fosforylaci eNOS (obr. 3d). Dále byl poměr fosforylovaného eNOS v aktivačním a inhibičním místě vypočítán po normalizaci množství fosforylovaného eNOS k celkovému množství enzymu. Tento poměr byl významně zvýšen v HUVEC ošetřených každou koncentrací DEET ve srovnání s neošetřenými buňkami (obr. 3d).
Exprese VEGF, jednoho z hlavních proangiogenních faktorů, byla analyzována pomocí Western blottingu. DEET významně zvýšil expresi VEGF, zatímco pFHHSiD tuto expresi zcela blokoval.
Vzhledem k tomu, že účinky DEET jsou citlivé jak na farmakologickou blokádu, tak na downregulaci receptorů M3, testovali jsme hypotézu, že DEET by mohl zesilovat vápníkovou signalizaci. Překvapivě se DEET nepodařilo zvýšit cytoplazmatický vápník v HUVEC (data nejsou uvedena) a HEK/M3 (obr. 4a, b) pro obě použité koncentrace.
Čas zveřejnění: 30. prosince 2024