V této studii byly stimulační účinky kombinované léčbyregulátory růstu rostlinByl zkoumán vliv fosfolipidogeneze (2,4-D a kinetinu) a nanočástic oxidu železa (Fe₃O₄-NP) na morfogenezi a produkci sekundárních metabolitů in vitro u *Hypericum perforatum* L. Optimalizovaná úprava [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetin (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP (4 mg/l)] významně zlepšila růstové parametry rostlin: výška rostlin se zvýšila o 59,6 %, délka kořenů o 114,0 %, počet pupenů o 180,0 % a čerstvá hmotnost kalusu o 198,3 % ve srovnání s kontrolní skupinou. Tato kombinovaná úprava také zvýšila účinnost regenerace (50,85 %) a zvýšila obsah hypericinu o 66,6 %. Analýza GC-MS odhalila vysoký obsah hyperosidu, β-patholenu a cetylalkoholu, což představuje 93,36 % celkové plochy píku, zatímco obsah celkových fenolických látek a flavonoidů se zvýšil až o 80,1 %. Tyto výsledky naznačují, že regulátory růstu rostlin (PGR) a nanočástice Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) vykazují synergický účinek stimulací organogeneze a akumulace bioaktivních sloučenin, což představuje slibnou strategii pro biotechnologické zdokonalování léčivých rostlin.
Třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum L.), také známá jako třezalka tečkovaná, je vytrvalá bylina z čeledi Hypericaceae, která má ekonomickou hodnotu.[1] Mezi její potenciální bioaktivní složky patří přírodní třísloviny, xantony, floroglucinol, naftalendianthron (hyperin a pseudohyperin), flavonoidy, fenolové kyseliny a esenciální oleje.[2,3,4] Třezalku tečkovanou lze množit tradičními metodami; sezónnost tradičních metod, nízká klíčivost semen a náchylnost k chorobám však omezují její potenciál pro velkopěstování a nepřetržitou tvorbu sekundárních metabolitů.[1,5,6]
Kultivace tkání in vitro je proto považována za účinnou metodu pro rychlé množení rostlin, ochranu zdrojů zárodečné plazmy a zvýšení výtěžku léčivých látek [7, 8]. Regulátory růstu rostlin (PGR) hrají klíčovou roli v regulaci morfogeneze a jsou nezbytné pro kultivaci kalusu a celých organismů in vitro. Optimalizace jejich koncentrací a kombinací je klíčová pro úspěšné dokončení těchto vývojových procesů [9]. Pochopení vhodného složení a koncentrace regulátorů je proto důležité pro zlepšení růstu a regenerační schopnosti třezalky tečkované (H. perforatum) [10].
Nanočástice oxidu železa (Fe₃O₄) jsou třídou nanočástic, které byly nebo jsou vyvíjeny pro tkáňové kultury. Fe₃O₄ má významné magnetické vlastnosti, dobrou biokompatibilitu a schopnost podporovat růst rostlin a snižovat stres prostředí, takže přitahuje značnou pozornost v oblasti návrhů tkáňových kultur. Potenciální aplikace těchto nanočástic mohou zahrnovat optimalizaci in vitro kultury pro podporu buněčného dělení, zlepšení příjmu živin a aktivaci antioxidačních enzymů [11].
Přestože nanočástice prokázaly dobré stimulační účinky na růst rostlin, studie o kombinované aplikaci nanočástic Fe₃O₄ a optimalizovaných regulátorů růstu rostlin u *H. perforatum* zůstávají vzácné. Aby se tato mezera ve znalostech zaplnila, tato studie hodnotila účinky jejich kombinovaných účinků na morfogenezi in vitro a produkci sekundárních metabolitů s cílem poskytnout nové poznatky pro zlepšení vlastností léčivých rostlin. Tato studie má proto dva cíle: (1) optimalizovat koncentraci regulátorů růstu rostlin pro účinnou podporu tvorby kalusu, regenerace výhonků a zakořeňování in vitro; a (2) vyhodnotit účinky nanočástic Fe₃O₄ na parametry růstu in vitro. Budoucí plány zahrnují vyhodnocení míry přežití regenerovaných rostlin během aklimatizace (in vitro). Očekává se, že výsledky této studie významně zlepší účinnost mikropropagace *H. perforatum*, a tím přispějí k udržitelnému využívání a biotechnologickým aplikacím této důležité léčivé rostliny.
V této studii jsme získali listové explantáty z polních jednoletých rostlin třezalky tečkované (mateřské rostliny). Tyto explantáty byly použity k optimalizaci podmínek kultivace in vitro. Před kultivací byly listy několik minut důkladně opláchnuty pod tekoucí destilovanou vodou. Povrchy explantátů byly poté dezinfikovány ponořením do 70% ethanolu na 30 sekund a následným ponořením do 1,5% roztoku chlornanu sodného (NaOCl) obsahujícího několik kapek Tween 20 na 10 minut. Nakonec byly explantáty třikrát opláchnuty sterilní destilovanou vodou a poté přeneseny do dalšího kultivačního média.
Během následujících čtyř týdnů byly měřeny parametry regenerace výhonků, včetně rychlosti regenerace, počtu výhonků na explantát a délky výhonku. Když regenerované výhonky dosáhly délky alespoň 2 cm, byly přeneseny do kořenového média sestávajícího z poloviční koncentrace MS média, 0,5 mg/l kyseliny indolmáselné (IBA) a 0,3 % guarové gumy. Zakořeňovací kultura pokračovala tři týdny, během kterých byla měřena rychlost zakořeňování, počet kořenů a délka kořenů. Každé ošetření bylo opakováno třikrát, přičemž na jedno ošetření bylo kultivováno 10 explantátů, což vedlo k přibližně 30 explantátům na ošetření.
Výška rostlin byla měřena v centimetrech (cm) pomocí pravítka, od báze rostliny ke špičce nejvyššího listu. Délka kořenů byla měřena v milimetrech (mm) ihned po opatrném vyjmutí sazenic a odstranění pěstebního média. Počet pupenů na explantát byl spočítán přímo na každé rostlině. Počet černých skvrn na listech, známých jako uzlíky, byl měřen vizuálně. Tyto černé uzlíky jsou považovány za žlázy obsahující hypericin neboli oxidační skvrny a používají se jako fyziologický indikátor reakce rostliny na ošetření. Po odstranění veškerého pěstebního média byla čerstvá hmotnost sazenic měřena pomocí elektronické váhy s přesností na miligramy (mg).
Metoda pro výpočet rychlosti tvorby kalusu je následující: po čtyřech týdnech kultivace explantátů v médiu obsahujícím různé regulátory růstu (kinázy, 2,4-D a Fe3O4) se spočítá počet explantátů schopných tvořit kalus. Vzorec pro výpočet rychlosti tvorby kalusu je následující:
Každé ošetření bylo opakováno třikrát, přičemž v každém opakování bylo vyšetřeno alespoň 10 explantátů.
Rychlost regenerace odráží podíl kalusové tkáně, která úspěšně dokončí proces diferenciace pupenů po fázi tvorby kalusu. Tento ukazatel prokazuje schopnost kalusové tkáně transformovat se do diferencované tkáně a růst do nových rostlinných orgánů.
Koeficient zakořenění je poměr počtu větví schopných zakořenit k celkovému počtu větví. Tento ukazatel odráží úspěšnost fáze zakořeňování, která je klíčová při mikropropagaci a množení rostlin, protože dobré zakořenění pomáhá sazenicím lépe přežít v pěstebních podmínkách.
Hypericinové sloučeniny byly extrahovány 90% methanolem. Padesát mg sušeného rostlinného materiálu bylo přidáno do 1 ml methanolu a sonikováno po dobu 20 minut při 30 kHz v ultrazvukovém čističi (model A5120-3YJ) při pokojové teplotě ve tmě. Po sonikaci byl vzorek centrifugován při 6000 ot/min po dobu 15 minut. Supernatant byl odebrán a absorbance hypericinu byla měřena při 592 nm pomocí spektrofotometru Plus-3000 S podle metody popsané Conceiçao et al. [14].
Většina ošetření regulátory růstu rostlin (PGR) a nanočásticemi oxidu železa (Fe₃O₄-NP) nevyvolala tvorbu černých uzlíků na regenerovaných listech výhonků. U žádného z ošetření s 0,5 nebo 1 mg/l 2,4-D, 0,5 nebo 1 mg/l kinetinu ani s 1, 2 nebo 4 mg/l nanočásticemi oxidu železa nebyly pozorovány žádné uzlíky. Několik kombinací vykazovalo mírné zvýšení vývoje uzlíků (ale ne statisticky významné) při vyšších koncentracích kinetinu a/nebo nanočástic oxidu železa, jako například kombinace 2,4-D (0,5–2 mg/l) s kinetinem (1–1,5 mg/l) a nanočásticemi oxidu železa (2–4 mg/l). Tyto výsledky jsou znázorněny na obrázku 2. Černé uzlíky představují žlázy bohaté na hypericin, které se vyskytují jak přirozeně, tak i prospěšné. V této studii byly černé uzlíky spojovány hlavně s hnědnutím tkání, což naznačuje příznivé prostředí pro akumulaci hypericinu. Ošetření nanočásticemi 2,4-D, kinetinu a Fe₃O₄ podpořilo růst kalusu, snížilo hnědnutí a zvýšilo obsah chlorofylu, což naznačuje zlepšení metabolické funkce a potenciální snížení oxidačního poškození [37]. Tato studie hodnotila účinky kinetinu v kombinaci s nanočásticemi 2,4-D a Fe₃O₄ na růst a vývoj kalusu třezalky tečkované (obr. 3a–g). Předchozí studie ukázaly, že nanočástice Fe₃O₄ mají antifungální a antimikrobiální účinky [38, 39] a při použití v kombinaci s regulátory růstu rostlin mohou stimulovat obranné mechanismy rostlin a snižovat indexy buněčného stresu [18]. Ačkoli je biosyntéza sekundárních metabolitů geneticky regulována, jejich skutečný výtěžek je vysoce závislý na podmínkách prostředí. Metabolické a morfologické změny mohou ovlivnit hladiny sekundárních metabolitů regulací exprese specifických rostlinných genů a reakcí na faktory prostředí. Induktory mohou dále spustit aktivaci nových genů, které následně stimulují enzymatickou aktivitu, což v konečném důsledku aktivuje více biosyntetických drah a vede k tvorbě sekundárních metabolitů. Jiná studie dále ukázala, že snížení zastínění zvyšuje expozici slunečnímu záření, a tím zvyšuje denní teploty v přirozeném prostředí *Hypericum perforatum*, což také přispívá ke zvýšenému výtěžku hypericinu. Na základě těchto údajů tato studie zkoumala roli nanočástic železa jako potenciálních induktorů v tkáňových kultuřech. Výsledky ukázaly, že tyto nanočástice mohou aktivovat geny zapojené do biosyntézy hesperidinu prostřednictvím enzymatické stimulace, což vede ke zvýšené akumulaci této sloučeniny (obr. 2). Ve srovnání s rostlinami rostoucími v přirozených podmínkách lze tedy tvrdit, že produkce těchto sloučenin in vivo může být také zvýšena, když je mírný stres kombinován s aktivací genů zapojených do biosyntézy sekundárních metabolitů. Kombinované ošetření má obecně pozitivní vliv na rychlost regenerace, ale v některých případech je tento účinek oslaben. Zejména ošetření 1 mg/l 2,4-D, 1,5 mg/l kinázy a různými koncentracemi by mohlo nezávisle a významně zvýšit rychlost regenerace o 50,85 % ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 4c). Tyto výsledky naznačují, že specifické kombinace nanohormonů mohou synergicky působit a podporovat růst rostlin a produkci metabolitů, což má velký význam pro tkáňové kultury léčivých rostlin. Palmer a Keller [50] ukázali, že ošetření 2,4-D může nezávisle indukovat tvorbu kalusu u St. perforatum, zatímco přidání kinázy významně zlepšilo tvorbu a regeneraci kalusu. Tento účinek byl způsoben zlepšením hormonální rovnováhy a stimulací buněčného dělení. Bal a kol. [51] zjistili, že ošetření Fe₃O₄-NP může nezávisle zvýšit funkci antioxidačních enzymů, a tím podpořit růst kořenů u St. perforatum. Kultivační média obsahující nanočástice Fe₃O₄ v koncentracích 0,5 mg/l, 1 mg/l a 1,5 mg/l zlepšila rychlost regenerace rostlin lnu [52]. Použití kinetinu, 2,4-dichlorbenzothiazolinonu a nanočástic Fe₃O₄ významně zlepšilo rychlost tvorby kalusu a kořenů, je však třeba zvážit potenciální vedlejší účinky použití těchto hormonů pro regeneraci in vitro. Například dlouhodobé nebo vysoce koncentrované používání 2,4-dichlorbenzothiazolinonu nebo kinetinu může vést k somatické klonální variabilitě, oxidačnímu stresu, abnormální morfologii kalusu nebo vitrifikaci. Vysoká míra regenerace proto nemusí nutně předpovídat genetickou stabilitu. Všechny regenerované rostliny by měly být posouzeny pomocí molekulárních markerů (např. RAPD, ISSR, AFLP) nebo cytogenetické analýzy, aby se určila jejich homogenita a podobnost s rostlinami in vivo [53,54,55].
Tato studie poprvé prokázala, že kombinované použití regulátorů růstu rostlin (2,4-D a kinetinu) s nanočásticemi Fe₃O₄ může zvýšit morfogenezi a akumulaci klíčových bioaktivních metabolitů (včetně hypericinu a hyperosidu) u *Hypericum perforatum*. Optimalizovaný léčebný režim (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetinu + 4 mg/l Fe₃O₄-NP) nejen maximalizoval tvorbu kalusu, organogenezi a výtěžek sekundárních metabolitů, ale také prokázal mírný indukční účinek, který potenciálně zlepšuje toleranci rostliny vůči stresu a její léčivou hodnotu. Kombinace nanotechnologií a rostlinných tkáňových kultur poskytuje udržitelnou a efektivní platformu pro velkovýrobu léčivých látek in vitro. Tyto výsledky otevírají cestu pro průmyslové aplikace a budoucí výzkum molekulárních mechanismů, optimalizace dávkování a genetické přesnosti, čímž propojují základní výzkum léčivých rostlin s praktickou biotechnologií.
Čas zveřejnění: 12. prosince 2025