Růst apikálního meristému (SAM) je kritický pro architekturu stonku. Rostlinné hormonygibereliny(GA) hrají klíčovou roli při koordinaci růstu rostlin, ale jejich role v SAM zůstává nedostatečně pochopena. Zde jsme vyvinuli poměrový biosenzor signalizace GA inženýrstvím proteinu DELLA k potlačení jeho základní regulační funkce v transkripční reakci GA při zachování jeho degradace při rozpoznání GA. Ukazujeme, že tento biosenzor založený na degradaci přesně zaznamenává změny hladin GA a buněčného snímání během vývoje. Tento biosenzor jsme použili k mapování signalizační aktivity GA v SAM. Ukazujeme, že signály s vysokým GA jsou přítomny převážně v buňkách umístěných mezi orgánovými primordii, které jsou prekurzory internodiálních buněk. S použitím přístupů se ziskem a ztrátou funkce dále prokazujeme, že GA reguluje orientaci roviny buněčného dělení, čímž vytváří kanonickou buněčnou organizaci internodií, čímž podporuje specifikaci internodů v SAM.
Apikální meristém výhonku (SAM), umístěný na vrcholu výhonku, obsahuje výklenek kmenových buněk, jejichž aktivita generuje postranní orgány a kmenové uzly modulárním a iterativním způsobem po celý život rostliny. Každá z těchto opakujících se jednotek neboli uzlin rostlin zahrnuje internodia a laterální orgány v uzlech a axilární meristémy v paždí listů1. Růst a organizace rostlinných uzlů se během vývoje mění. U Arabidopsis je internodální růst během vegetativního stádia potlačen a axilární meristémy zůstávají v paždí listů růžicí latentní. Během přechodu do květové fáze se SAM stává meristémem květenství, generujícím protáhlá internodia a axilární pupeny, větévky v paždí karabinových listů a později bezlisté květy2. Přestože jsme dosáhli významného pokroku v pochopení mechanismů, které řídí iniciaci listů, květů a větví, o tom, jak vznikají internodia, je známo poměrně málo.
Pochopení časoprostorové distribuce GA pomůže lépe porozumět funkcím těchto hormonů v různých tkáních a v různých vývojových stádiích. Vizualizace degradace fúze RGA-GFP vyjádřené působením vlastního promotoru poskytuje důležité informace o regulaci celkových hladin GA v kořenech15,16. Exprese RGA se však v různých tkáních liší17 a je regulována GA18. Rozdílná exprese promotoru RGA tedy může vést k fluorescenčnímu vzoru pozorovanému s RGA-GFP, a proto tato metoda není kvantitativní. Nedávno bioaktivní fluoresceinem (Fl) značený GA19,20 odhalil akumulaci GA v kořenovém endokortexu a regulaci jeho buněčných hladin transportem GA. Nedávno senzor GA FRET nlsGPS1 ukázal, že hladiny GA korelují s prodloužením buněk v kořenech, vláknech a tmavě rostoucích hypokotylech21. Jak jsme však viděli, koncentrace GA není jediným parametrem řídícím signalizační aktivitu GA, protože závisí na složitých procesech snímání. Zde, na základě našeho porozumění signálním drahám DELLA a GA, uvádíme vývoj a charakterizaci poměrového biosenzoru založeného na degradaci pro signalizaci GA. K vývoji tohoto kvantitativního biosenzoru jsme použili mutantní RGA citlivý na GA, který byl fúzován s fluorescenčním proteinem a všudypřítomně exprimovaný v tkáních, stejně jako fluorescenční protein necitlivý na GA. Ukazujeme, že mutantní proteinové fúze RGA neinterferují s endogenní signalizací GA, když jsou všudypřítomné exprimovány, a že tento biosenzor může kvantifikovat signalizační aktivitu vyplývající ze vstupu GA i zpracování signálu GA snímacím zařízením s vysokým časoprostorovým rozlišením. Tento biosenzor jsme použili k mapování časoprostorové distribuce signalizační aktivity GA a kvantifikaci toho, jak GA reguluje buněčné chování v epidermis SAM. Ukazujeme, že GA reguluje orientaci roviny dělení buněk SAM umístěných mezi orgánovými primordii, čímž definuje kanonickou buněčnou organizaci internodia.
Nakonec jsme se zeptali, zda qmRGA může hlásit změny v endogenních hladinách GA pomocí rostoucích hypokotylů. Již dříve jsme ukázali, že dusičnany stimulují růst zvýšením syntézy GA a následně degradace DELLA34. V souladu s tím jsme pozorovali, že délka hypokotylu v sazenicích pUBQ10::qmRGA pěstovaných za bohaté nabídky dusičnanů (10 mM NO3-) byla významně delší než u sazenic pěstovaných za podmínek s nedostatkem dusičnanů (doplňkový obr. 6a). V souladu s růstovou odpovědí byly signály GA vyšší u hypokotylů sazenic pěstovaných za podmínek 10 mM NO3- než u sazenic pěstovaných v nepřítomnosti dusičnanů (doplňkový obrázek 6b, c). qmRGA tedy také umožňuje sledování změn v signalizaci GA indukovaných endogenními změnami koncentrace GA.
Abychom pochopili, zda signální aktivita GA detekovaná pomocí qmRGA závisí na koncentraci GA a vnímání GA, jak se očekávalo na základě návrhu senzoru, analyzovali jsme expresi tří receptorů GID1 ve vegetativních a reprodukčních tkáních. U semenáčků reportérová linie GID1-GUS ukázala, že GID1a a c byly vysoce exprimovány v kotyledonech (obr. 3a–c). Kromě toho byly všechny tři receptory exprimovány v listech, postranních kořenových primordiích, kořenových špičkách (kromě kořenového uzávěru GID1b) a cévním systému (obr. 3a–c). V květenství SAM jsme detekovali signály GUS pouze pro GID1b a 1c (doplňkový obr. 7a–c). In situ hybridizace potvrdila tyto expresní vzory a dále prokázala, že GID1c byl jednotně exprimován na nízkých hladinách v SAM, zatímco GID1b vykazoval vyšší expresi na periferii SAM (doplňkový obr. 7d–l). Translační fúze pGID1b::2xmTQ2-GID1b také odhalila odstupňovaný rozsah exprese GID1b, od nízké nebo žádné exprese ve středu SAM po vysokou expresi na hranicích orgánů (doplňkový obrázek 7m). Receptory GID1 tedy nejsou rovnoměrně distribuovány napříč a uvnitř tkání. V následných experimentech jsme také pozorovali, že nadměrná exprese GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) zvýšila citlivost qmRGA v hypokotylech na externí aplikaci GA (obr. 3d, e). Naproti tomu fluorescence měřená pomocí qdl7mRGA v hypokotylu byla necitlivá na ošetření GA3 (obr. 3f, g). Pro oba testy byly semenáčky ošetřeny vysokými koncentracemi GA (100 μM GA3), aby se vyhodnotilo rychlé chování senzoru, kde byla zesílena nebo ztracena schopnost vázat se na GID1 receptor. Tyto výsledky společně potvrzují, že biosenzor qmRGA plní kombinovanou funkci jako senzor GA a GA, a naznačují, že rozdílná exprese receptoru GID1 může významně modulovat emisivitu senzoru.
K dnešnímu dni zůstává distribuce signálů GA v SAM nejasná. Proto jsme použili rostliny exprimující qmRGA a reportér kmenových buněk pCLV3::mCherry-NLS35 k výpočtu kvantitativních map signální aktivity GA s vysokým rozlišením se zaměřením na vrstvu L1 (epidermis; obr. 4a, b, viz Metody a doplňkové metody), protože L1 hraje klíčovou roli při řízení růstu SAM36. Zde exprese pCLV3::mCherry-NLS poskytla pevný geometrický referenční bod pro analýzu časoprostorové distribuce signalizační aktivity GA37. Ačkoli je GA považována za zásadní pro vývoj laterálních orgánů4, pozorovali jsme, že signály GA byly nízké v květinovém primordiu (P) počínaje fází P3 (obr. 4a, b), zatímco mladá primordia P1 a P2 měla mírnou aktivitu podobnou té v centrální oblasti (obr. 4a, b). Vyšší signální aktivita GA byla detekována na hranicích orgánového primordia, počínaje P1/P2 (na stranách hranice) a vrcholila na P4, stejně jako ve všech buňkách periferní oblasti nacházející se mezi primordii (obr. 4a, b a doplňkový obr. 8a, b). Tato vyšší signalizační aktivita GA byla pozorována nejen v epidermis, ale také ve vrstvách L2 a horních L3 (doplňkový obrázek 8b). Vzor signálů GA detekovaných v SAM pomocí qmRGA také zůstal v průběhu času nezměněn (doplňkový obrázek 8c–f, k). Přestože byl konstrukt qd17mRGA systematicky downregulován v SAM rostlin T3 z pěti nezávislých linií, které jsme podrobně charakterizovali, byli jsme schopni analyzovat fluorescenční vzory získané s konstruktem pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (doplňkový obrázek 8g–j, l). V této kontrolní linii byly v SAM detekovány pouze malé změny v poměru fluorescence, ale v centru SAM jsme pozorovali jasný a neočekávaný pokles VENUŠE spojený s TagBFP. To potvrzuje, že signální vzor pozorovaný qmRGA odráží degradaci mRGA-VENUS závislou na GA, ale také ukazuje, že qmRGA může nadhodnocovat signální aktivitu GA v centru meristému. Stručně řečeno, naše výsledky odhalují signální vzorec GA, který primárně odráží distribuci primordia. Tato distribuce interprimordiální oblasti (IPR) je způsobena postupným nastolením vysoké signalizační aktivity GA mezi vyvíjejícím se primordiem a centrální oblastí, přičemž současně klesá signalizační aktivita GA v primordiu (obr. 4c, d).
Distribuce receptorů GID1b a GID1c (viz výše) naznačuje, že rozdílná exprese receptorů GA pomáhá utvářet vzorec signalizační aktivity GA v SAM. Zajímalo nás, zda může být zapojena diferenciální akumulace GA. K prozkoumání této možnosti jsme použili senzor nlsGPS1 GA FRET21. Zvýšená aktivační frekvence byla zjištěna v SAM nlsGPS1 ošetřeného 10 μM GA4+7 po dobu 100 minut (doplňkový obr. 9a–e), což naznačuje, že nlsGPS1 reaguje na změny koncentrace GA v SAM, stejně jako v kořenech21. Prostorová distribuce frekvence aktivace nlsGPS1 odhalila relativně nízké hladiny GA ve vnějších vrstvách SAM, ale ukázala, že byly zvýšené ve středu a na hranicích SAM (obr. 4e a doplňkový obr. 9a, c). To naznačuje, že GA je také distribuován v SAM s prostorovým vzorem srovnatelným s tím, který odhalil qmRGA. Jako doplňkový přístup jsme také ošetřili SAM fluorescenčním GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) nebo samotným Fl jako negativní kontrolou. Signál Fl byl distribuován v celém SAM, včetně centrální oblasti a primordia, i když s nižší intenzitou (obr. 4j a doplňkový obr. 10d). Naproti tomu všechny tři GA-Fl se akumulovaly specificky v hranicích primordia a v různé míře ve zbytku IPR, přičemž GA7-Fl se akumuloval v největší doméně v IPR (obr. 4k a doplňkový obr. 10a,b). Kvantifikace intenzity fluorescence odhalila, že poměr intenzity IPR k intenzitě bez IPR byl vyšší v SAM ošetřeném GA-Fl ve srovnání s SAM ošetřeným Fl (obr. 41 a doplňkový obrázek 10c). Tyto výsledky společně naznačují, že GA je přítomen ve vyšších koncentracích v IPR buňkách, které jsou umístěny nejblíže k hranici orgánu. To naznačuje, že vzor signální aktivity SAM GA vyplývá jak z rozdílné exprese receptorů GA, tak z rozdílné akumulace GA v buňkách IPR blízko hranic orgánů. Naše analýza tedy odhalila neočekávaný časoprostorový vzorec signalizace GA s nižší aktivitou ve středu a primordiu SAM a vyšší aktivitou v IPR v periferní oblasti.
Abychom pochopili roli diferenciální signalizační aktivity GA v SAM, analyzovali jsme korelaci mezi signalizační aktivitou GA, buněčnou expanzí a buněčným dělením pomocí časosběrného zobrazování SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS v reálném čase. Vzhledem k roli GA v regulaci růstu se očekávala pozitivní korelace s parametry buněčné expanze. Proto jsme nejprve porovnali mapy signální aktivity GA s mapami rychlosti růstu buněčného povrchu (jako proxy pro sílu buněčné expanze pro danou buňku a pro dceřiné buňky při dělení) a s mapami anizotropie růstu, která měří směrovost buněčné expanze (zde se také používá pro danou buňku a pro dceřiné buňky při dělení; obr. 5a,b, viz Metody a doplňkové metody). Naše mapy rychlosti růstu povrchu buněk SAM jsou v souladu s předchozími pozorováními38,39 s minimální rychlostí růstu na okraji a maximální rychlostí růstu u vyvíjejících se květů (obr. 5a). Analýza hlavní složky (PCA) ukázala, že signalizační aktivita GA negativně korelovala s intenzitou růstu buněčného povrchu (obrázek 5c). Také jsme ukázali, že hlavní osy variace, včetně vstupu signalizace GA a intenzity růstu, byly ortogonální ke směru určenému vysokou expresí CLV3, což potvrdilo vyloučení buněk z centra SAM ve zbývajících analýzách. Spearmanova korelační analýza potvrdila výsledky PCA (obrázek 5d), což ukazuje, že vyšší signály GA v IPR nevedly k vyšší expanzi buněk. Korelační analýza však odhalila mírnou pozitivní korelaci mezi signalizační aktivitou GA a růstovou anizotropií (obrázek 5c, d), což naznačuje, že vyšší signalizace GA v IPR ovlivňuje směr buněčného růstu a možná i polohu roviny buněčného dělení.
a, b Tepelné mapy průměrného povrchového růstu (a) a růstové anizotropie (b) v SAM zprůměrované pro sedm nezávislých rostlin (použité jako zástupné hodnoty pro sílu a směr buněčné expanze, v tomto pořadí). c PCA analýza zahrnovala následující proměnné: GA signál, intenzita povrchového růstu, anizotropie povrchového růstu a exprese CLV3. PCA složka 1 byla převážně negativně korelována s intenzitou růstu povrchu a pozitivně korelovala se signálem GA. PCA složka 2 byla hlavně pozitivně korelována s anizotropií povrchového růstu a negativně korelovala s expresí CLV3. Procenta představují variaci vysvětlenou každou složkou. d Spearmanova korelační analýza mezi GA signálem, intenzitou povrchového růstu a anizotropií povrchového růstu v tkáňovém měřítku s výjimkou CZ. Číslo vpravo je Spearmanova hodnota rho mezi dvěma proměnnými. Hvězdičky označují případy, kdy je korelace/negativní korelace vysoce významná. e 3D vizualizace buněk Col-0 SAM L1 konfokální mikroskopií. Nové buněčné stěny vytvořené v SAM (ale ne v primordiu) po 10 hodinách jsou zbarveny podle jejich hodnot úhlu. Barevný pruh je zobrazen v pravém dolním rohu. Vložka zobrazuje odpovídající 3D obraz v 0 h. Experiment byl opakován dvakrát s podobnými výsledky. f Rámečkové grafy zobrazují rychlosti buněčného dělení v IPR a non-IPR Col-0 SAM (n = 10 nezávislých rostlin). Středová čára ukazuje medián a hranice rámečku označují 25. a 75. percentil. Whiskery označují minimální a maximální hodnoty určené pomocí softwaru R. Hodnoty P byly získány pomocí Welchova dvoustranného t-testu. g, h Schematický diagram znázorňující (g), jak změřit úhel nové buněčné stěny (purpurová) vzhledem k radiálnímu směru od středu SAM (bílá tečkovaná čára) (uvažují se pouze hodnoty ostrého úhlu, tj. 0–90°), a (h) obvodové/laterální a radiální směry v meristému. i Frekvenční histogramy orientace roviny buněčného dělení napříč SAM (tmavě modrá), IPR (středně modrá) a non-IPR (světle modrá). Hodnoty P byly získány dvoustranným Kolmogorov-Smirnovovým testem. Experiment byl opakován dvakrát s podobnými výsledky. j Frekvenční histogramy orientace roviny buněčného dělení IPR kolem P3 (světle zelená), P4 (středně zelená) a P5 (tmavě zelená). Hodnoty P byly získány dvoustranným Kolmogorov-Smirnovovým testem. Experiment byl opakován dvakrát s podobnými výsledky.
Proto jsme dále zkoumali korelaci mezi signalizací GA a aktivitou buněčného dělení identifikací nově vytvořených buněčných stěn během testu (obr. 5e). Tento přístup nám umožnil měřit frekvenci a směr buněčného dělení. Překvapivě jsme zjistili, že frekvence dělení buněk v IPR a ve zbytku SAM (non-IPR, obr. 5f) byla podobná, což ukazuje, že rozdíly v GA signalizaci mezi IPR a non-IPR buňkami významně neovlivňují buněčné dělení. Toto a pozitivní korelace mezi signalizací GA a růstovou anizotropií nás přiměly zvážit, zda by signalizační aktivita GA mohla ovlivnit orientaci roviny buněčného dělení. Změřili jsme orientaci nové buněčné stěny jako ostrý úhel vzhledem k radiální ose spojující střed meristému a střed nové buněčné stěny (obr. 5e-i) a pozorovali jsme jasnou tendenci buněk dělit se v úhlech blízkých 90° vzhledem k radiální ose, přičemž nejvyšší frekvence byly pozorovány při 70–80° (23,28,2 %) a 8 %) 5e,i), odpovídající buněčným dělením v obvodovém/příčném směru (obr. 5h). Abychom prozkoumali příspěvek GA signalizace k tomuto chování při dělení buněk, analyzovali jsme parametry buněčného dělení v IPR a non-IPR samostatně (obr. 5i). Pozorovali jsme, že distribuce úhlu dělení v buňkách IPR se lišila od distribuce v buňkách bez IPR nebo v buňkách v celém SAM, přičemž buňky IPR vykazovaly vyšší podíl laterálních/kruhových buněčných dělení, tj. 70–80° a 80–90° (odpovídající podíly 33,86 %, resp. 30,71 %) (obr. 5i). Naše pozorování tedy odhalila souvislost mezi vysokou signalizací GA a orientací roviny buněčného dělení blízko obvodovému směru, podobnou korelaci mezi signalizační aktivitou GA a růstovou anizotropií (obr. 5c, d). Pro další stanovení prostorové konzervace této asociace jsme měřili orientaci roviny dělení v IPR buňkách obklopujících primordium počínaje od P3, protože nejvyšší GA signalizační aktivita byla detekována v této oblasti počínaje od P4 (obr. 4). Úhly dělení IPR kolem P3 a P4 nevykazovaly žádné statisticky významné rozdíly, ačkoli u IPR kolem P4 byla pozorována zvýšená frekvence laterálních buněčných dělení (obr. 5j). V IPR buňkách kolem P5 se však rozdíl v orientaci roviny buněčného dělení stal statisticky významným, s prudkým nárůstem frekvence příčných buněčných dělení (obr. 5j). Tyto výsledky společně naznačují, že GA signalizace může řídit orientaci buněčných dělení v SAM, což je v souladu s předchozími zprávami40, 41 že vysoká GA signalizace může indukovat laterální orientaci buněčných dělení v IPR.
Předpokládá se, že buňky v IPR nebudou inkorporovány do primordií, ale spíše do internodií2,42,43. Příčná orientace buněčných dělení v IPR může vést k typické organizaci paralelních podélných řad epidermálních buněk v internodiích. Naše pozorování popsaná výše naznačují, že GA signalizace pravděpodobně hraje roli v tomto procesu regulací směru buněčného dělení.
Ztráta funkce několika genů DELLA má za následek konstitutivní odpověď GA a k testování této hypotézy lze použít della mutanty44. Nejprve jsme analyzovali expresní vzorce pěti genů DELLA v SAM. Transkripční fúze linie GUS45 odhalila, že GAI, RGA, RGL1 a RGL2 (v mnohem menší míře) byly exprimovány v SAM (doplňkový obr. 11a–d). In situ hybridizace dále prokázala, že GAI mRNA se specificky akumuluje v primordiích a vyvíjejících se květech (doplňkový obrázek 11e). RGL1 a RGL3 mRNA byly detekovány v celém baldachýnu SAM a ve starších květinách, zatímco mRNA RGL2 byla hojnější v hraniční oblasti (doplňkový obr. 11f–h). Konfokální zobrazování pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo expresi pozorovanou in situ hybridizací a ukázalo, že RGL3 protein se akumuluje v centrální části SAM (doplňkový obrázek 11i). Pomocí linie pRGA::GFP-RGA jsme také zjistili, že protein RGA se akumuluje v SAM, ale jeho množství klesá na hranici počínaje P4 (doplňkový obrázek 11j). Je pozoruhodné, že expresní vzory RGL3 a RGA jsou konzistentní s vyšší signalizační aktivitou GA v IPR, jak bylo detekováno pomocí qmRGA (obr. 4). Navíc tato data naznačují, že všechny DELLA jsou vyjádřeny v SAM a že jejich exprese společně pokrývá celý SAM.
Dále jsme analyzovali parametry buněčného dělení u standardního typu SAM (Ler, kontrola) a gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della pětinásobných (globálních) mutantů (obr. 6a, b). Zajímavé je, že jsme pozorovali statisticky významný posun v distribuci frekvencí úhlu buněčného dělení u della globální mutanty SAM ve srovnání s divokým typem (obr. 6c). Tato změna u della globálního mutanta byla způsobena zvýšením frekvence úhlů 80–90° (34,71 % vs. 24,55 %) a v menší míře úhlů 70–80 ° (23,78 % vs. 20,18 %), tedy odpovídajících příčným buněčným dělením (obr. 6c). Frekvence nepříčných dělení (0–60°) byla také nižší u della global mutant (obr. 6c). Frekvence příčných buněčných dělení byla významně zvýšena v SAM della global mutant (obr. 6b). Frekvence příčných buněčných dělení v IPR byla také vyšší u della globálního mutantu ve srovnání s divokým typem (obr. 6d). Mimo oblast IPR měl divoký typ rovnoměrnější rozložení úhlů buněčného dělení, zatímco della globální mutant preferoval tangenciální dělení jako IPR (obr. 6e). Také jsme kvantifikovali orientaci buněčných dělení v SAM pětinásobných mutantů ga2 oxidázy (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 a ga2ox6-2), GA-inaktivního mutantního pozadí, ve kterém se akumuluje GA. V souladu se zvýšením hladin GA byl SAM pětinásobného mutantního květenství ga2ox větší než u Col-0 (doplňkový obrázek 12a, b) a ve srovnání s Col-0 vykazoval pětinásobný ga2ox SAM zřetelně odlišnou distribuci úhlů buněčného dělení, přičemž frekvence úhlu se zvýšila z 50° na opět 90° tangenciální dělení (obr. S. 12a–c). Ukazujeme tedy, že konstitutivní aktivace signalizace GA a akumulace GA indukují laterální dělení buněk v IPR a ve zbytku SAM.
a, b 3D vizualizace vrstvy L1 PI-barveného Ler (a) a globálního della mutantu (b) SAM pomocí konfokální mikroskopie. Nové buněčné stěny vytvořené v SAM (ale ne v primordiu) během 10 hodin jsou zobrazeny a zbarveny podle jejich hodnot úhlu. Vložka ukazuje SAM v 0 h. Barevný pruh se zobrazí v pravém dolním rohu. Šipka v (b) ukazuje na příklad zarovnaných buněčných souborů v globálním della mutantu. Experiment byl opakován dvakrát s podobnými výsledky. ce srovnání frekvenčního rozložení orientací rovin buněčného dělení v celé SAM (d), IPR (e) a non-IPR (f) mezi Ler a globální della. Hodnoty P byly získány pomocí dvoustranného Kolmogorov-Smirnovova testu. f, g 3D vizualizace konfokálních snímků PI-barvených SAM transgenních rostlin Col-0 (i) a pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panely (a, b) ukazují nové buněčné stěny (ale ne primordia) vytvořené v SAM během 10 hodin. Experiment byl opakován dvakrát s podobnými výsledky. h–j Porovnání frekvenčního rozložení orientací rovin buněčného dělení lokalizovaných v celém SAM (h), IPR (i) a non-IPR (j) mezi rostlinami Col-0 a pCUC2::gai-1-VENUS. Hodnoty P byly získány pomocí dvoustranného Kolmogorov-Smirnovova testu.
Dále jsme testovali účinek inhibice GA signalizace specificky v IPR. Za tímto účelem jsme použili promotor kotyledon cup 2 (CUC2) k řízení exprese dominantního negativního proteinu gai-1 fúzovaného s VENUŠE (v linii pCUC2::gai-1-VENUS). V SAM divokého typu řídí promotor CUC2 expresi většiny IPR v SAM, včetně hraničních buněk, od P4 dále a podobná specifická exprese byla pozorována v rostlinách pCUC2::gai-1-VENUS (viz níže). Distribuce úhlů buněčného dělení napříč SAM nebo IPR rostlin pCUC2::gai-1-VENUS se významně nelišila od divokého typu, i když jsme neočekávaně zjistili, že buňky bez IPR v těchto rostlinách se dělily s vyšší frekvencí 80–90° (obr. 6f–j).
Bylo navrženo, že směr buněčného dělení závisí na geometrii SAM, zejména na tahovém napětí generovaném zakřivením tkáně46. Proto jsme se zeptali, zda byl tvar SAM změněn v rostlinách della global mutant a pCUC2::gai-1-VENUS. Jak bylo uvedeno dříve12, velikost della globální mutanty SAM byla větší než velikost divokého typu (doplňkový obrázek 13a, b, d). In situ hybridizace CLV3 a STM RNA potvrdila expanzi meristému v della mutantech a dále ukázala laterální expanzi niky kmenových buněk (doplňkový obrázek 13e, f, h, i). Zakřivení SAM však bylo podobné v obou genotypech (doplňkový obrázek 13k, m, n, p). Pozorovali jsme podobný nárůst velikosti u čtyřnásobného mutantu gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della bez změny zakřivení ve srovnání s divokým typem (doplňkový obrázek 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvence orientace buněčného dělení byla ovlivněna také u čtyřnásobného mutanta della, ale v menší míře než u monolitického mutantu della (doplňkový obr. 12d–f). Tento účinek dávkování spolu s nedostatečným účinkem na zakřivení naznačuje, že zbytková aktivita RGL3 ve čtyřnásobném mutantu Della omezuje změny v orientaci buněčného dělení způsobené ztrátou aktivity DELLA a že ke změnám v laterálních buněčných děleních dochází spíše v reakci na změny v signalizační aktivitě GA než na změny v geometrii SAM. Jak je popsáno výše, promotor CUC2 řídí expresi IPR v SAM počínaje P4 (doplňkový obrázek 14a, b) a naopak pCUC2::gai-1-VENUS SAM měl zmenšenou velikost, ale vyšší zakřivení (doplňkový obrázek 14c–h). Tato změna v morfologii pCUC2::gai-1-VENUS SAM může mít za následek odlišnou distribuci mechanických napětí ve srovnání s divokým typem, ve kterém vysoká obvodová napětí začínají v kratší vzdálenosti od centra SAM47. Alternativně mohou změny v morfologii pCUC2::gai-1-VENUS SAM vyplývat ze změn regionálních mechanických vlastností vyvolaných expresí transgenu48. V obou případech by to mohlo částečně kompenzovat účinky změn v signalizaci GA zvýšením pravděpodobnosti, že se buňky budou dělit v obvodové/příčné orientaci, což vysvětluje naše pozorování.
Celkově vzato naše data potvrzují, že vyšší signalizace GA hraje aktivní roli v laterální orientaci roviny buněčného dělení v IPR. Ukazují také, že zakřivení meristému také ovlivňuje orientaci roviny buněčného dělení v IPR.
Příčná orientace roviny dělení v IPR v důsledku vysoké signalizační aktivity GA naznačuje, že GA předorganizuje radiální buněčný soubor v epidermis v SAM, aby definoval buněčnou organizaci, která se později najde v epidermálním internodu. Ve skutečnosti byly takové buněčné soubory často viditelné na obrázcích SAM globálních mutantů della (obr. 6b). Abychom tedy dále prozkoumali vývojovou funkci prostorového vzoru signalizace GA v SAM, použili jsme časosběrné zobrazování k analýze prostorové organizace buněk v IPR v transgenních rostlinách divokého typu (Ler a Col-0), della globálních mutantech a pCUC2::gai-1-VENUS.
Zjistili jsme, že qmRGA ukázal, že signalizační aktivita GA v IPR se zvýšila z P1/P2 a dosáhla vrcholu na P4, a tento vzor zůstal v průběhu času konstantní (obr. 4a–f a doplňkový obr. 8c–f, k). Abychom analyzovali prostorovou organizaci buněk v IPR se zvyšujícím se signálem GA, označili jsme Ler IPR buňky nad a po stranách P4 podle jejich vývojového osudu analyzovaného 34 hodin po prvním pozorování, tj. více než dvakrát plastidové časy, což nám umožňuje sledovat IPR buňky během vývoje primordia z P1/P2 na P4. Použili jsme tři různé barvy: žlutou pro ty buňky, které byly integrovány do primordia poblíž P4, zelenou pro ty, které byly v IPR, a fialovou pro ty, které se účastnily obou procesů (obr. 7a–c). V t0 (0 h) byly před P4 viditelné 1–2 vrstvy buněk IPR (obr. 7a). Jak se dalo očekávat, když se tyto buňky dělily, dělaly tak hlavně přes rovinu příčného dělení (obr. 7a–c). Podobné výsledky byly získány s použitím Col-0 SAM (zaměřeno na P3, jehož okraj se skládá podobně jako P4 u Ler), i když v tomto genotypu záhyb vytvořený na květinovém okraji skryl buňky IPR rychleji (obr. 7g–i). Vzor dělení buněk IPR tedy předem organizuje buňky do radiálních řad, jako v internodiích. Organizace radiálních řad a lokalizace IPR buněk mezi po sobě jdoucími orgány naznačuje, že tyto buňky jsou internodální progenitory.
Zde jsme vyvinuli poměrový signální biosenzor GA, qmRGA, který umožňuje kvantitativní mapování signální aktivity GA vyplývající z kombinovaných koncentrací receptorů GA a GA při minimalizaci interference s endogenními signálními cestami, čímž poskytuje informace o funkci GA na buněčné úrovni. Za tímto účelem jsme zkonstruovali modifikovaný protein DELLA, mRGA, který ztratil schopnost vázat interakční partnery DELLA, ale zůstává citlivý na proteolýzu vyvolanou GA. qmRGA reaguje na exogenní i endogenní změny hladin GA a jeho dynamické snímací vlastnosti umožňují hodnocení časoprostorových změn signalizační aktivity GA během vývoje. qmRGA je také velmi flexibilní nástroj, protože jej lze přizpůsobit různým tkáním změnou promotoru použitého pro jeho expresi (v případě potřeby), a vzhledem ke konzervované povaze signální dráhy GA a motivu PFYRE napříč krytosemennými rostlinami je pravděpodobné, že bude přenosný na jiné druhy22. V souladu s tím se také ukázalo, že ekvivalentní mutace v rýžovém proteinu SLR1 DELLA (HYY497AAA) potlačuje aktivitu represoru růstu SLR1, zatímco pouze mírně snižuje jeho GA-zprostředkovanou degradaci, podobně jako mRGA23. Nedávné studie u Arabidopsis ukázaly, že jediná mutace aminokyseliny v doméně PFYRE (S474L) změnila transkripční aktivitu RGA, aniž by ovlivnila jeho schopnost interagovat s partnery transkripčních faktorů50. Ačkoli je tato mutace velmi blízká 3 aminokyselinovým substitucím přítomným v mRGA, naše studie ukazují, že tyto dvě mutace mění odlišné charakteristiky DELLA. Ačkoli se většina partnerů transkripčních faktorů váže na domény LHR1 a SAW DELLA26,51, některé konzervované aminokyseliny v doméně PFYRE mohou pomoci stabilizovat tyto interakce.
Vývoj internod je klíčovým rysem v architektuře rostlin a zlepšování výnosů. qmRGA odhalil vyšší signalizační aktivitu GA v progenitorových buňkách internodií IPR. Kombinací kvantitativního zobrazování a genetiky jsme ukázali, že signální vzory GA překrývají kruhové/příčné roviny buněčného dělení v epidermis SAM, čímž formují organizaci buněčného dělení potřebnou pro vývoj internodií. Během vývoje bylo identifikováno několik regulátorů orientace roviny buněčného dělení52,53. Naše práce poskytuje jasný příklad toho, jak signalizační aktivita GA reguluje tento buněčný parametr. DELLA může interagovat s prefolding proteinovými komplexy41, takže GA signalizace může regulovat orientaci roviny buněčného dělení přímým ovlivněním orientace kortikálních mikrotubulů40,41,54,55. Neočekávaně jsme ukázali, že u SAM korelátem vyšší signalizační aktivity GA nebylo prodlužování nebo dělení buněk, ale pouze anizotropie růstu, což je v souladu s přímým účinkem GA na směr buněčného dělení v IPR. Nemůžeme však vyloučit, že tento účinek by mohl být také nepřímý, například zprostředkovaný GA-indukovaným měknutím buněčné stěny56. Změny vlastností buněčné stěny vyvolávají mechanické napětí57,58, které může také ovlivnit orientaci roviny buněčného dělení ovlivněním orientace kortikálních mikrotubulů39,46,59. Kombinované účinky mechanického namáhání vyvolaného GA a přímé regulace orientace mikrotubulů pomocí GA se mohou podílet na vytváření specifického vzoru orientace buněčného dělení v IPR k definování internodií a k testování této myšlenky jsou zapotřebí další studie. Podobně předchozí studie zdůraznily důležitost proteinů TCP14 a 15 interagujících s DELLA při kontrole tvorby internodií60,61 a tyto faktory mohou zprostředkovat působení GA spolu s BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), které regulují vývoj internodií a bylo prokázáno, že ovlivňují signalizaci GA2,62. Vzhledem k tomu, že DELLA interagují se signálními cestami brassinosteroidu, ethylenu, kyseliny jasmonové a kyseliny abscisové (ABA)63,64 a že tyto hormony mohou ovlivňovat orientaci mikrotubulů65, mohou být účinky GA na orientaci buněčného dělení zprostředkovány také jinými hormony.
Časné cytologické studie ukázaly, že vnitřní i vnější oblasti Arabidopsis SAM jsou nezbytné pro vývoj internodií2,42. Skutečnost, že GA aktivně reguluje buněčné dělení ve vnitřních tkáních12, podporuje dvojí funkci GA při regulaci velikosti meristému a internodia v SAM. Vzor směrového buněčného dělení je také přísně regulován ve vnitřní tkáni SAM a tato regulace je nezbytná pro růst stonku52. Bude zajímavé prozkoumat, zda GA také hraje roli v orientaci roviny buněčného dělení ve vnitřní organizaci SAM, a tím synchronizuje specifikaci a vývoj internodií v rámci SAM.
Rostliny byly pěstovány in vitro v půdě nebo 1x Murashige-Skoog (MS) médiu (Duchefa) doplněném 1% sacharózou a 1% agarem (Sigma) za standardních podmínek (16 h světlo, 22 °C), s výjimkou experimentů s hypokotylem a růstem kořenů, ve kterých byly sazenice pěstovány na vertikálních plotnách za konstantního světla a 22 °C. Pro nitrátové experimenty byly rostliny pěstovány na modifikovaném MS médiu (bioWORLD rostlinné médium) doplněném adekvátním dusičnanem (0 nebo 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinátem, 1 % sacharózou a 1 % A-agarem (Sigma) za podmínek dlouhého dne.
GID1a cDNA vložená do pDONR221 byla rekombinována s pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry do pB7m34GW za vzniku pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA vložená do pDONR221 byla rekombinována do pB7RWG266 za vzniku p35S:IDD2-RFP. Aby se vytvořil pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3,9 kb fragment upstream od kódující oblasti GID1b a 4,7 kb fragment obsahující GID1b cDNA (1,3 kb) a terminátor (3,4 kb) byly nejprve amplifikovány s použitím primerů v doplňkové tabulce pDO1RTheNR a poté vloženy do Fisher P4P4rific pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), v tomto pořadí, a nakonec rekombinovaný s pDONR221 2xmTQ268 do cílového vektoru pGreen 012567 pomocí klonování Gateway. Pro generování pCUC2::LSSmOrange byla sekvence promotoru CUC2 (3229 bp upstream od ATG) následovaná kódující sekvencí velkého Stokesově posunutého mOrange (LSSmOrange)69 s N7 jaderným lokalizačním signálem a terminátorem transkripce NOS sestavena do pGreen kanamycinového zaměřovacího vektoru 3fragbingbin. Rostlinný binární vektor byl zaveden do Agrobacterium tumefaciens kmene GV3101 a zaveden do listů Nicotiana benthamiana metodou infiltrace Agrobacterium a do Arabidopsis thaliana Col-0 metodou květinového máčení, v daném pořadí. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GIDla-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA byly izolovány z F3 a F1 potomků příslušných křížení, v daném pořadí.
Hybridizace RNA in situ byla provedena na přibližně 1 cm dlouhých špičkách výhonků72, které byly odebrány a okamžitě fixovány v roztoku FAA (3,7 % formaldehyd, 5 % kyselina octová, 50 % ethanol) předem ochlazeném na 4 °C. Po 2 x 15 minutách působení vakua bylo fixační činidlo vyměněno a vzorky byly inkubovány přes noc. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 a RGL3 cDNA a antisense sondy k jejich 3'-UTR byly syntetizovány pomocí primerů uvedených v doplňkové tabulce 3, jak je popsáno v Rosier et al.73. Sondy značené digoxigeninem byly imunodetekovány pomocí protilátek proti digoxigeninu (3000násobné ředění; Roche, katalogové číslo: 11 093 274 910) a řezy byly obarveny 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátem (BCIP, 250násobné ředění tetrazoliovým (250násobným ředěním)/nitromodř.0T.
Čas odeslání: 10. února 2025