Růst apikálního meristému (SAM) výhonku je zásadní pro architekturu stonku. Rostlinné hormonygibereliny(GA) hrají klíčovou roli v koordinaci růstu rostlin, ale jejich role v SAM (samostatné aminokyselinové bázi) zůstává nedostatečně pochopena. V této studii jsme vyvinuli poměrový biosenzor signalizace GA modifikací proteinu DALLAS tak, aby potlačil jeho základní regulační funkci v transkripční odpovědi GA a zároveň zachoval jeho degradaci po rozpoznání GA. Ukazujeme, že tento biosenzor založený na degradaci přesně zaznamenává změny hladin GA a buněčného snímání během vývoje. Tento biosenzor jsme použili k mapování aktivity signalizace GA v SAM. Ukazujeme, že vysoké signály GA jsou přítomny převážně v buňkách umístěných mezi orgánovými primordiemi, které jsou prekurzory internodiálních buněk. Pomocí přístupů zisku a ztráty funkce dále demonstrujeme, že GA reguluje orientaci roviny buněčného dělení, čímž vytváří kanonickou buněčnou organizaci internodií, a tím podporuje specifikaci internodií v SAM.
Apikální meristém výhonku (SAM), nacházející se na vrcholu výhonku, obsahuje skupinu kmenových buněk, jejichž aktivita modulárním a iterativním způsobem generuje postranní orgány a stonkové uzly po celou dobu života rostliny. Každá z těchto opakujících se jednotek neboli rostlinných uzlů zahrnuje internodia a postranní orgány v uzlech a axilární meristémy v paždí listů1. Růst a organizace rostlinných uzlů se během vývoje mění. U Arabidopsis je růst internodií během vegetativní fáze potlačen a axilární meristémy zůstávají dormantní v paždí růžicových listů. Během přechodu do květní fáze se SAM stává květenstvím a vytváří protáhlé internodia a axilární pupeny, větvičky v paždí stonkových listů a později bezlisté květy2. Ačkoli jsme dosáhli významného pokroku v pochopení mechanismů, které řídí vznik listů, květů a větví, o tom, jak internodia vznikají, je známo relativně málo.
Pochopení časoprostorového rozložení GA pomůže lépe pochopit funkce těchto hormonů v různých tkáních a v různých vývojových stádiích. Vizualizace degradace fúze RGA-GFP exprimované působením vlastního promotoru poskytuje důležité informace o regulaci celkových hladin GA v kořenech15,16. Exprese RGA se však v různých tkáních liší17 a je regulována GA18. Diferenciální exprese promotoru RGA tedy může vést k fluorescenčnímu vzoru pozorovanému u RGA-GFP, a proto tato metoda není kvantitativní. V nedávné době bioaktivní fluoresceinem (Fl) značená GA19,20 odhalila akumulaci GA v endokortexu kořenů a regulaci jejích buněčných hladin transportem GA. Nedávno senzor GA FRET nlsGPS1 ukázal, že hladiny GA korelují s prodloužením buněk v kořenech, filamentech a tmavě rostoucích hypokotylech21. Jak jsme však viděli, koncentrace GA není jediným parametrem řídícím signální aktivitu GA, protože závisí na komplexních senzorických procesech. Zde, na základě našeho chápání signálních drah a GA, prezentujeme vývoj a charakterizaci degradačního poměrového biosenzoru pro signalizaci GA. Pro vývoj tohoto kvantitativního biosenzoru jsme použili mutantní RGA citlivý na GA, který byl fúzován s fluorescenčním proteinem a všudypřítomně exprimován v tkáních, a také fluorescenční protein necitlivý na GA. Ukazujeme, že fúze mutantních RGA proteinů neinterferují s endogenní signalizací GA, pokud jsou všudypřítomně exprimovány, a že tento biosenzor dokáže kvantifikovat signální aktivitu vyplývající jak ze vstupu GA, tak ze zpracování signálu GA senzorickým zařízením s vysokým časoprostorovým rozlišením. Tento biosenzor jsme použili k mapování časoprostorového rozložení signální aktivity GA a kvantifikaci toho, jak GA reguluje buněčné chování v epidermis SAM. Ukazujeme, že GA reguluje orientaci roviny dělení buněk SAM umístěných mezi orgánovými primordiemi, čímž definuje kanonickou buněčnou organizaci internodia.
Nakonec jsme se ptali, zda by qmRGA mohla hlásit změny v hladinách endogenní GA s využitím rostoucích hypokotylů. Dříve jsme ukázali, že dusičnany stimulují růst zvýšením syntézy GA a následně degradací DNA34. V souladu s tím jsme pozorovali, že délka hypokotylů u sazenic pUBQ10::qmRGA pěstovaných za hojného přísunu dusičnanů (10 mM NO3−) byla významně delší než u sazenic pěstovaných v podmínkách s nedostatkem dusičnanů (doplňkový obrázek 6a). V souladu s růstovou reakcí byly signály GA vyšší v hypokotylech sazenic pěstovaných za podmínek 10 mM NO3− než u sazenic pěstovaných bez dusičnanů (doplňkový obrázek 6b, c). QmRGA tak také umožňuje monitorování změn v signalizaci GA vyvolaných endogenními změnami v koncentraci GA.
Abychom pochopili, zda signální aktivita GA detekovaná pomocí qmRGA závisí na koncentraci GA a vnímání GA, jak se očekávalo na základě designu senzoru, analyzovali jsme expresi tří receptorů GID1 ve vegetativních a reprodukčních tkáních. U sazenic reportérová linie GID1-GUS ukázala, že GID1a a c byly vysoce exprimovány v děložních děložních listech (obr. 3a–c). Kromě toho byly všechny tři receptory exprimovány v listech, primordiích laterálních kořenů, kořenových špičkách (s výjimkou kořenové čepičky GID1b) a cévním systému (obr. 3a–c). V květenství SAM jsme detekovali signály GUS pouze pro GID1b a 1c (doplňkový obr. 7a–c). Hybridizace in situ tyto expresní vzorce potvrdila a dále prokázala, že GID1c byl v SAM rovnoměrně exprimován v nízkých hladinách, zatímco GID1b vykazoval vyšší expresi na periferii SAM (doplňkový obr. 7d–l). Translační fúze pGID1b::2xmTQ2-GID1b také odhalila stupňovitý rozsah exprese GID1b, od nízké nebo žádné exprese ve středu SAM až po vysokou expresi na okrajích orgánů (doplňkový obrázek 7m). Receptory GID1 tedy nejsou rovnoměrně rozloženy napříč tkáněmi a uvnitř nich. V následných experimentech jsme také pozorovali, že nadměrná exprese GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) zvýšila citlivost qmRGA v hypokotylech na vnější aplikaci GA (obr. 3d, e). Naproti tomu fluorescence měřená pomocí qd17mRGA v hypokotylu byla necitlivá na ošetření GA3 (obr. 3f, g). V obou testech byly sazenice ošetřeny vysokými koncentracemi GA (100 μM GA3), aby se posoudilo rychlé chování senzoru, kde byla schopnost vázat se na receptor GID1 zvýšena nebo ztracena. Tyto výsledky společně potvrzují, že biosenzor qmRGA slouží k kombinované funkci senzoru GA a GA, a naznačují, že diferenciální exprese receptoru GID1 může významně modulovat emisivitu senzoru.
Distribuce signálů GA v SAM dosud zůstává nejasná. Proto jsme použili rostliny exprimující qmRGA a reportér kmenových buněk pCLV3::mCherry-NLS35 k výpočtu kvantitativních map signální aktivity GA s vysokým rozlišením, se zaměřením na vrstvu L1 (epidermis; obr. 4a, b, viz Metody a doplňkové metody), protože L1 hraje klíčovou roli v regulaci růstu SAM36. Zde exprese pCLV3::mCherry-NLS poskytla pevný geometrický referenční bod pro analýzu časoprostorového rozložení signální aktivity GA37. Ačkoli je GA považována za nezbytnou pro vývoj laterálních orgánů4, pozorovali jsme, že signály GA byly nízké v květním primordiu (P) počínaje stádiem P3 (obr. 4a, b), zatímco mladá primordia P1 a P2 vykazovala střední aktivitu podobnou té v centrální oblasti (obr. 4a, b). Vyšší signální aktivita GA byla detekována na hranicích primordia orgánů, počínaje P1/P2 (po stranách hranice) a vrcholící v P4, stejně jako ve všech buňkách periferní oblasti nacházející se mezi primordii (obr. 4a, b a doplňkový obr. 8a, b). Tato vyšší signální aktivita GA byla pozorována nejen v epidermis, ale také ve vrstvách L2 a horní L3 (doplňkový obr. 8b). Vzorec signálů GA detekovaný v SAM pomocí qmRGA také zůstal v průběhu času nezměněn (doplňkový obr. 8c–f, k). Ačkoli byl konstrukt qd17mRGA systematicky downregulován v SAM rostlin T3 z pěti nezávislých linií, které jsme podrobně charakterizovali, byli jsme schopni analyzovat fluorescenční vzory získané s konstruktem pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (doplňkový obr. 8g–j, l). V této kontrolní linii byly v SAM detekovány pouze drobné změny ve fluorescenčním poměru, ale v centru SAM jsme pozorovali jasný a neočekávaný pokles VENUS asociovaného s TagBFP. To potvrzuje, že signální vzorec pozorovaný pomocí qmRGA odráží GA-dependentní degradaci mRGA-VENUS, ale také ukazuje, že qmRGA může nadhodnocovat signální aktivitu GA v centru meristému. Stručně řečeno, naše výsledky odhalují signální vzorec GA, který primárně odráží distribuci primordií. Tato distribuce interprimordiální oblasti (IPR) je způsobena postupným nastolením vysoké signální aktivity GA mezi vyvíjejícím se primordiem a centrální oblastí, zatímco současně signální aktivita GA v primordiu klesá (obr. 4c, d).
Distribuce receptorů GID1b a GID1c (viz výše) naznačuje, že rozdílná exprese receptorů GA pomáhá utvářet vzorec signální aktivity GA v SAM. Zajímalo nás, zda by mohla být zapojena rozdílná akumulace GA. Pro prozkoumání této možnosti jsme použili senzor nlsGPS1 GA FRET21. Zvýšená aktivační frekvence byla detekována v SAM nlsGPS1 ošetřeného 10 μM GA4+7 po dobu 100 minut (doplňkový obr. 9a–e), což naznačuje, že nlsGPS1 reaguje na změny koncentrace GA v SAM, stejně jako v kořenech21. Prostorové rozložení aktivační frekvence nlsGPS1 odhalilo relativně nízké hladiny GA ve vnějších vrstvách SAM, ale ukázalo se, že byly zvýšené ve středu a na okrajích SAM (obr. 4e a doplňkový obr. 9a,c). To naznačuje, že GA je také distribuována v SAM s prostorovým vzorem srovnatelným s tím, který odhalil qmRGA. Jako doplňkový přístup jsme SAM také ošetřili fluorescenčním GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) nebo samotným Fl jako negativní kontrolou. Signál Fl byl distribuován v celém SAM, včetně centrální oblasti a primordia, i když s nižší intenzitou (obr. 4j a doplňkový obr. 10d). Naproti tomu všechny tři GA-Fl se akumulovaly specificky v okrajích primordia a v různé míře i ve zbytku IPR, přičemž GA7-Fl se akumuloval v největší doméně v IPR (obr. 4k a doplňkový obr. 10a,b). Kvantifikace intenzity fluorescence ukázala, že poměr intenzity IPR k intenzitě bez IPR byl vyšší u SAM ošetřeného GA-Fl ve srovnání se SAM ošetřeným Fl (obr. 4l a doplňkový obr. 10c). Tyto výsledky dohromady naznačují, že GA je přítomna ve vyšších koncentracích v buňkách IPR, které se nacházejí nejblíže k okraji orgánu. To naznačuje, že vzorec signální aktivity SAM GA je výsledkem jak diferenciální exprese receptorů GA, tak diferenciální akumulace GA v buňkách IPR v blízkosti okrajů orgánů. Naše analýza tak odhalila neočekávaný časoprostorový vzorec GA signalizace s nižší aktivitou v centru a primordiu SAM a vyšší aktivitou v IPR v periferní oblasti.
Abychom pochopili roli diferenciální signální aktivity GA v SAM, analyzovali jsme korelaci mezi signální aktivitou GA, buněčnou expanzí a buněčným dělením pomocí časosběrného zobrazování SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS v reálném čase. Vzhledem k roli GA v regulaci růstu se očekávala pozitivní korelace s parametry buněčné expanze. Proto jsme nejprve porovnali mapy signální aktivity GA s mapami rychlosti růstu buněčného povrchu (jako zástupce síly buněčné expanze pro danou buňku a pro dceřiné buňky při dělení) a s mapami růstové anizotropie, která měří směrovost buněčné expanze (zde také použita pro danou buňku a pro dceřiné buňky při dělení; obr. 5a,b, viz Metody a doplňkové metody). Naše mapy rychlosti růstu buněčného povrchu SAM jsou v souladu s předchozími pozorováními38,39, s minimálními rychlostmi růstu na hranici a maximálními rychlostmi růstu ve vyvíjejících se květech (obr. 5a). Analýza hlavních komponent (PCA) ukázala, že signální aktivita GA negativně korelovala s intenzitou růstu buněčného povrchu (obrázek 5c). Také jsme ukázali, že hlavní osy variace, včetně vstupu GA signalizace a intenzity růstu, byly ortogonální ke směru určenému vysokou expresí CLV3, což potvrzuje vyloučení buněk z centra SAM ve zbývajících analýzách. Spearmanova korelační analýza potvrdila výsledky PCA (obrázek 5d), což naznačuje, že vyšší GA signály v IPR nevedly k vyšší buněčné expanzi. Korelační analýza však odhalila mírnou pozitivní korelaci mezi aktivitou GA signalizace a anizotropií růstu (obrázek 5c, d), což naznačuje, že vyšší GA signalizace v IPR ovlivňuje směr růstu buněk a pravděpodobně i polohu roviny buněčného dělení.
a, b Tepelné mapy průměrného povrchového růstu (a) a anizotropie růstu (b) v SAM zprůměrované přes sedm nezávislých rostlin (použité jako aproximace síly a směru buněčné expanze). c PCA analýza zahrnovala následující proměnné: signál GA, intenzitu povrchového růstu, anizotropii povrchového růstu a expresi CLV3. Složka PCA 1 korelovala převážně negativně s intenzitou povrchového růstu a pozitivně s GA signálem. Složka PCA 2 korelovala převážně pozitivně s anizotropií povrchového růstu a negativně s expresí CLV3. Procenta představují variaci vysvětlenou každou složkou. d Spearmanova korelační analýza mezi signálem GA, intenzitou povrchového růstu a anizotropií povrchového růstu v tkáňovém měřítku s výjimkou CZ. Číslo vpravo je Spearmanova hodnota rho mezi dvěma proměnnými. Hvězdičky označují případy, kdy je korelace/negativní korelace vysoce významná. e 3D vizualizace buněk Col-0 SAM L1 konfokální mikroskopií. Nové buněčné stěny vytvořené v SAM (ale ne v primordiu) po 10 hodinách jsou zbarveny podle hodnot jejich úhlu. Barevný sloupec je zobrazen v pravém dolním rohu. Vložený obrázek ukazuje odpovídající 3D obraz v čase 0 h. Experiment byl dvakrát opakován s podobnými výsledky. f Krabicové grafy zobrazují rychlosti buněčného dělení v IPR a non-IPR Col-0 SAM (n = 10 nezávislých rostlin). Středová čára ukazuje medián a hranice rámečků označují 25. a 75. percentil. Vousy označují minimální a maximální hodnoty stanovené pomocí softwaru R. Hodnoty P byly získány pomocí Welchova oboustranného t-testu. g, h Schematický diagram znázorňující (g) jak měřit úhel nové buněčné stěny (purpurová) vzhledem k radiálnímu směru od středu SAM (bílá tečkovaná čára) (uvažují se pouze hodnoty ostrého úhlu, tj. 0–90°), a (h) obvodový/laterální a radiální směr v rámci meristému. i Frekvenční histogramy orientace roviny buněčného dělení napříč SAM (tmavě modrá), IPR (středně modrá) a non-IPR (světle modrá). Hodnoty P byly získány oboustranným Kolmogorovovým-Smirnovovým testem. Experiment byl dvakrát opakován s podobnými výsledky. j Frekvenční histogramy orientace roviny buněčného dělení IPR kolem P3 (světle zelená), P4 (středně zelená) a P5 (tmavě zelená). Hodnoty P byly získány oboustranným Kolmogorovovým-Smirnovovým testem. Experiment byl dvakrát opakován s podobnými výsledky.
Proto jsme dále zkoumali korelaci mezi signalizací GA a aktivitou buněčného dělení identifikací nově vytvořených buněčných stěn během testu (obr. 5e). Tento přístup nám umožnil měřit frekvenci a směr buněčného dělení. Překvapivě jsme zjistili, že frekvence buněčných dělení v IPR a zbytku SAM (bez IPR, obr. 5f) byla podobná, což naznačuje, že rozdíly v signalizaci GA mezi buňkami s IPR a bez IPR významně neovlivňují buněčné dělení. Toto a pozitivní korelace mezi signalizací GA a anizotropií růstu nás vedla k úvaze, zda by aktivita signalizace GA mohla ovlivnit orientaci roviny buněčného dělení. Orientaci nové buněčné stěny jsme změřili jako ostrý úhel vzhledem k radiální ose spojující střed meristému a střed nové buněčné stěny (obr. 5e-i) a pozorovali jsme jasnou tendenci buněk k dělení v úhlech blízkých 90° vzhledem k radiální ose, s nejvyššími frekvencemi pozorovanými při 70–80° (23,28 %) a 80–90° (22,62 %) (obr. 5e,i), což odpovídá buněčnému dělení v obvodovém/příčném směru (obr. 5h). Abychom prozkoumali příspěvek signalizace GA k tomuto chování buněčného dělení, analyzovali jsme parametry buněčného dělení v IPR a non-IPR samostatně (obr. 5i). Pozorovali jsme, že distribuce úhlů dělení v buňkách IPR se lišila od distribuce v buňkách bez IPR nebo v buňkách v celém SAM, přičemž buňky IPR vykazovaly vyšší podíl laterálních/kruhových buněčných dělení, tj. 70–80° a 80–90° (33,86 % a 30,71 %, odpovídající poměry) (obr. 5i). Naše pozorování tedy odhalila souvislost mezi vysokou GA signalizací a orientací roviny dělení buněk blízkou obvodovému směru, podobnou korelaci mezi aktivitou GA signalizace a anizotropií růstu (obr. 5c, d). Pro další stanovení prostorové konzervace této asociace jsme měřili orientaci roviny dělení v buňkách IPR obklopujících primordium počínaje od P3, protože nejvyšší aktivita GA signalizace byla detekována v této oblasti počínaje P4 (obr. 4). Úhly dělení IPR kolem P3 a P4 nevykazovaly žádné statisticky významné rozdíly, ačkoli v IPR kolem P4 byla pozorována zvýšená frekvence laterálních buněčných dělení (obr. 5j). V buňkách IPR kolem P5 se však rozdíl v orientaci roviny buněčného dělení stal statisticky významným s prudkým nárůstem frekvence příčných buněčných dělení (obr. 5j). Tyto výsledky dohromady naznačují, že signalizace GA může řídit orientaci buněčných dělení v SAM, což je v souladu s předchozími zprávami40,41, že vysoká signalizace GA může indukovat laterální orientaci buněčných dělení v IPR.
Předpokládá se, že buňky v IPR nebudou začleněny do primordií, ale spíše do internodií2,42,43. Příčná orientace buněčných dělení v IPR může vést k typické organizaci paralelních podélných řad epidermálních buněk v internodiích. Naše výše popsaná pozorování naznačují, že GA signalizace pravděpodobně hraje v tomto procesu roli regulací směru buněčného dělení.
Ztráta funkce několika genů DNA vede ke konstitutivní GA odpovědi a k testování této hypotézy lze použít mutanty della44. Nejprve jsme analyzovali expresní vzorce pěti genů DNA v SAM. Transkripční fúze linie GUS45 odhalila, že GAI, RGA, RGL1 a RGL2 (v mnohem menší míře) byly exprimovány v SAM (doplňkový obrázek 11a–d). In situ hybridizace dále prokázala, že mRNA GAI se akumuluje specificky v primordiích a vyvíjejících se květech (doplňkový obrázek 11e). mRNA RGL1 a RGL3 byla detekována v celém koruně SAM a ve starších květech, zatímco mRNA RGL2 byla hojnější v hraniční oblasti (doplňkový obrázek 11f–h). Konfokální zobrazování pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo expresi pozorovanou in situ hybridizací a ukázalo, že protein RGL3 se akumuluje v centrální části SAM (doplňkový obrázek 11i). Pomocí linie pRGA::GFP-RGA jsme také zjistili, že protein RGA se akumuluje v SAM, ale jeho množství na hranici klesá počínaje P4 (doplňkový obr. 11j). Je pozoruhodné, že expresní vzorce RGL3 a RGA jsou v souladu s vyšší signální aktivitou GA v IPR, jak bylo detekováno pomocí qmRGA (obr. 4). Tato data navíc naznačují, že všechny DNA proteiny jsou exprimovány v SAM a že jejich exprese kolektivně pokrývá celý SAM.
Dále jsme analyzovali parametry buněčného dělení u divokého typu SAM (Ler, kontrola) a pětinásobných (globálních) mutantů gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (obr. 6a, b). Zajímavé je, že jsme pozorovali statisticky významný posun v rozložení frekvencí úhlů buněčného dělení u mutanta della global SAM ve srovnání s divokým typem (obr. 6c). Tato změna u mutanta della global byla způsobena zvýšením frekvence úhlů 80–90° (34,71 % vs. 24,55 %) a v menší míře úhlů 70–80° (23,78 % vs. 20,18 %), tj. odpovídá příčným buněčným dělením (obr. 6c). Frekvence nepříčných dělení (0–60°) byla také nižší u mutanta della global (obr. 6c). Frekvence příčných buněčných dělení byla významně zvýšena u SAM mutanta della global (obr. 6b). Frekvence příčných buněčných dělení v IPR byla také vyšší u mutanta della global ve srovnání s divokým typem (obr. 6d). Mimo oblast IPR měl divoký typ rovnoměrnější rozložení úhlů buněčného dělení, zatímco mutant della global preferoval tangenciální dělení, jako je IPR (obr. 6e). Také jsme kvantifikovali orientaci buněčných dělení v SAM pětinásobných mutantů ga2 oxidázy (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 a ga2ox6-2), což je mutantní pozadí neaktivní vůči GA, ve kterém se GA akumuluje. V souladu se zvýšením hladin GA byl SAM květenství pětinásobné mutanty ga2ox větší než u Col-0 (doplňkový obr. 12a, b) a ve srovnání s Col-0 vykazoval pětinásobný ga2ox SAM výrazně odlišné rozložení úhlů buněčného dělení, přičemž frekvence úhlu se zvyšovala z 50° na 90°, tj. opět ve prospěch tangenciálních dělení (doplňkový obr. 12a–c). Ukazujeme tedy, že konstitutivní aktivace GA signalizace a akumulace GA indukují laterální buněčné dělení v IPR a zbytku SAM.
a, b 3D vizualizace vrstvy L1 SAM barveného PI Ler (a) a globálního mutanta della (b) pomocí konfokální mikroskopie. Zobrazeny jsou nové buněčné stěny vytvořené v SAM (ale ne v primordiu) během 10 hodin a obarveny podle hodnot jejich úhlů. Vložka ukazuje SAM v čase 0 h. Barevný pruh je zobrazen v pravém dolním rohu. Šipka v (b) ukazuje na příklad zarovnaných buněčných souborů v globálním mutantu della. Experiment byl dvakrát opakován s podobnými výsledky. ce porovnání frekvenčního rozložení orientací rovin buněčného dělení v celém SAM (d), IPR (e) a non-IPR (f) mezi Ler a globálním mutantem della. Hodnoty P byly získány pomocí oboustranného Kolmogorovova-Smirnovova testu. f, g 3D vizualizace konfokálních obrazů SAM barveného PI transgenních rostlin Col-0 (i) a pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panely (a, b) ukazují nové buněčné stěny (ale nikoli primordia) vytvořené v SAM během 10 hodin. Experiment byl dvakrát opakován s podobnými výsledky. h–j Porovnání frekvenčního rozložení orientací rovin buněčného dělení v celém SAM (h), IPR (i) a non-IPR (j) mezi rostlinami Col-0 a pCUC2::gai-1-VENUS. Hodnoty P byly získány pomocí oboustranného Kolmogorovova-Smirnovova testu.
Dále jsme testovali účinek inhibice GA signalizace specificky v IPR. Za tímto účelem jsme použili promotor cotyledon cup 2 (CUC2) k řízení exprese dominantně negativního proteinu gai-1 fúzovaného s VENUS (v linii pCUC2::gai-1-VENUS). U SAM divokého typu řídí promotor CUC2 expresi většiny IPR v SAM, včetně hraničních buněk, od P4 dále a podobná specifická exprese byla pozorována u rostlin pCUC2::gai-1-VENUS (viz níže). Distribuce úhlů buněčného dělení napříč SAM nebo IPR rostlin pCUC2::gai-1-VENUS se významně nelišila od divokého typu, ačkoli jsme neočekávaně zjistili, že buňky bez IPR se v těchto rostlinách dělily s vyšší frekvencí 80–90° (obr. 6f–j).
Bylo navrženo, že směr buněčného dělení závisí na geometrii SAM, zejména na tahovém napětí generovaném zakřivením tkáně46. Proto jsme se ptali, zda se tvar SAM změnil u rostlin della global mutanta a pCUC2::gai-1-VENUS. Jak bylo popsáno dříve12, velikost SAM della global mutanta byla větší než u divokého typu (doplňkový obrázek 13a, b, d). In situ hybridizace CLV3 a STM RNA potvrdila expanzi meristému u mutantů della a dále ukázala laterální expanzi niky kmenových buněk (doplňkový obrázek 13e, f, h, i). Zakřivení SAM však bylo u obou genotypů podobné (doplňkový obrázek 13k, m, n, p). Podobné zvětšení velikosti jsme pozorovali u čtyřnásobného mutanta gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della bez změny zakřivení ve srovnání s divokým typem (doplňkový obrázek 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvence orientace buněčného dělení byla také ovlivněna u della quadruple mutanta, ale v menší míře než u della monolitic mutanta (doplňkový obrázek 12d–f). Tento dávkový efekt, spolu s absencí vlivu na zakřivení, naznačuje, že zbytková aktivita RGL3 u Della quadruple mutanta omezuje změny v orientaci buněčného dělení způsobené ztrátou aktivity DNA a že změny v laterálním buněčném dělení se vyskytují v reakci na změny v aktivitě signální dráhy GA spíše než na změny v geometrii SAM. Jak je popsáno výše, promotor CUC2 řídí expresi IPR v SAM počínaje P4 (doplňkový obrázek 14a, b) a naopak pCUC2::gai-1-VENUS SAM měl menší velikost, ale vyšší zakřivení (doplňkový obrázek 14c–h). Tato změna v morfologii pCUC2::gai-1-VENUS SAM může vést k odlišnému rozložení mechanických napětí ve srovnání s divokým typem, u kterého vysoká obvodová napětí začínají v kratší vzdálenosti od centra SAM47. Alternativně mohou změny v morfologii pCUC2::gai-1-VENUS SAM vyplývat ze změn v regionálních mechanických vlastnostech vyvolaných expresí transgenu48. V obou případech by to mohlo částečně kompenzovat účinky změn v GA signalizaci zvýšením pravděpodobnosti, že se buňky budou dělit v cirkumferenční/příčné orientaci, což vysvětluje naše pozorování.
Naše data dohromady potvrzují, že vyšší GA signalizace hraje aktivní roli v laterální orientaci roviny buněčného dělení v IPR. Ukazují také, že zakřivení meristému také ovlivňuje orientaci roviny buněčného dělení v IPR.
Příčná orientace roviny dělení v IPR, v důsledku vysoké aktivity signalizace GA, naznačuje, že GA preorganizuje radiální buněčný soubor v epidermis v rámci SAM, aby definoval buněčnou organizaci, která bude později nalezena v epidermálním internodiu. Takové buněčné soubory byly skutečně často viditelné na snímcích SAM u mutantů della global (obr. 6b). Abychom tedy dále prozkoumali vývojovou funkci prostorového vzoru signalizace GA v SAM, použili jsme časosběrné zobrazování k analýze prostorové organizace buněk v IPR u rostlin divokého typu (Ler a Col-0), mutantů della global a transgenních rostlin pCUC2::gai-1-VENUS.
Zjistili jsme, že qmRGA ukázala, že aktivita signální dráhy GA v IPR se zvyšovala od P1/P2 a vrcholila v P4 a tento vzorec zůstával v čase konstantní (obr. 4a–f a doplňkový obr. 8c–f, k). Pro analýzu prostorové organizace buněk v IPR se zvyšujícím se signálem GA jsme označili buňky Ler IPR nad a po stranách P4 podle jejich vývojového osudu analyzovaného 34 hodin po prvním pozorování, tj. více než dva plastidové časy, což nám umožnilo sledovat buňky IPR během vývoje primordia od P1/P2 do P4. Použili jsme tři různé barvy: žlutou pro buňky, které byly integrovány do primordia poblíž P4, zelenou pro ty, které byly v IPR, a fialovou pro ty, které se účastnily obou procesů (obr. 7a–c). V čase t0 (0 h) byly před P4 viditelné 1–2 vrstvy buněk IPR (obr. 7a). Jak se očekávalo, když se tyto buňky dělily, děly se tak převážně prostřednictvím příčné roviny dělení (obr. 7a–c). Podobné výsledky byly získány s použitím Col-0 SAM (se zaměřením na P3, jehož okraj se ohýbá podobně jako P4 u Ler), ačkoli u tohoto genotypu záhyb vytvořený na květním okraji skryl IPR buňky rychleji (obr. 7g–i). Dělicí vzorec IPR buněk je tedy předorganizuje do radiálních řad, jako v internodiích. Organizace radiálních řad a lokalizace IPR buněk mezi po sobě jdoucími orgány naznačuje, že tyto buňky jsou internodálními progenitory.
Zde jsme vyvinuli poměrový biosenzor pro signalizaci GA, qmRGA, který umožňuje kvantitativní mapování signální aktivity GA v důsledku kombinovaných koncentrací GA a receptorů GA a zároveň minimalizuje interferenci s endogenními signálními drahami, a tím poskytuje informace o funkci GA na buněčné úrovni. Za tímto účelem jsme zkonstruovali modifikovaný protein DNA, mRGA, který ztratil schopnost vázat se na interakční partnery DNA, ale zůstává citlivý na proteolýzu indukovanou GA. qmRGA reaguje na exogenní i endogenní změny hladin GA a jeho dynamické senzorické vlastnosti umožňují posouzení časoprostorových změn signální aktivity GA během vývoje. qmRGA je také velmi flexibilní nástroj, protože jej lze adaptovat na různé tkáně změnou promotoru použitého pro jeho expresi (pokud je to nutné), a vzhledem ke konzervované povaze signální dráhy GA a motivu PFYRE napříč krytosemennými rostlinami je pravděpodobné, že bude přenositelný na jiné druhy22. V souladu s tím bylo také prokázáno, že ekvivalentní mutace v proteinu SLR1 rýže (HYY497AAA) potlačuje represorovou aktivitu růstu proteinu SLR1, zatímco pouze mírně snižuje jeho degradaci zprostředkovanou GA, podobně jako u mRGA23. Je pozoruhodné, že nedávné studie na Arabidopsis ukázaly, že mutace jediné aminokyseliny v doméně PFYRE (S474L) změnila transkripční aktivitu RGA, aniž by ovlivnila jeho schopnost interagovat s partnerskými transkripčními faktory50. Ačkoli je tato mutace velmi blízká 3 substitucím aminokyselin přítomným v mRGA, naše studie ukazují, že tyto dvě mutace mění odlišné vlastnosti Přestože se většina partnerských transkripčních faktorů váže na domény LHR1 a SAW26,51, některé konzervované aminokyseliny v doméně PFYRE mohou pomoci tyto interakce stabilizovat.
Vývoj internodií je klíčovým znakem architektury rostlin a zlepšení výnosu. qmRGA odhalila vyšší signální aktivitu GA v progenitorových buňkách internodií IPR. Kombinací kvantitativního zobrazování a genetiky jsme ukázali, že signální vzory GA překrývají kruhové/příčné roviny buněčného dělení v epidermis SAM, čímž formují organizaci buněčného dělení potřebnou pro vývoj internodií. Během vývoje bylo identifikováno několik regulátorů orientace roviny buněčného dělení52,53. Naše práce poskytuje jasný příklad toho, jak signální aktivita GA reguluje tento buněčný parametr. může interagovat s komplexy proteinů před skládáním41, takže signalizace GA může regulovat orientaci roviny buněčného dělení přímým ovlivňováním orientace kortikálních mikrotubulů40,41,54,55. Neočekávaně jsme ukázali, že v SAM nebyl korelátem vyšší signální aktivity GA prodloužení nebo dělení buněk, ale pouze anizotropie růstu, což je v souladu s přímým vlivem GA na směr buněčného dělení v IPR. Nemůžeme však vyloučit, že tento účinek by mohl být i nepřímý, například zprostředkovaný změkčením buněčné stěny indukovaným GA56. Změny vlastností buněčné stěny indukují mechanické namáhání57,58, které může také ovlivnit orientaci roviny buněčného dělení ovlivněním orientace kortikálních mikrotubulů39,46,59. Kombinované účinky mechanického namáhání indukovaného GA a přímé regulace orientace mikrotubulů pomocí GA mohou být zapojeny do generování specifického vzoru orientace buněčného dělení v IPR pro definování internodií a k ověření této myšlenky jsou zapotřebí další studie. Podobně předchozí studie zdůraznily význam proteinů TCP14 a 15 interagujících s DNA v kontrole tvorby internodií60,61 a tyto faktory mohou zprostředkovávat působení GA společně s BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), které regulují vývoj internodií a u kterých bylo prokázáno, že ovlivňují signalizaci GA2,62. Vzhledem k tomu, že DNA interagují se signálními drahami brassinosteroidů, ethylenu, kyseliny jasmonové a kyseliny abscisové (ABA)63,64 a že tyto hormony mohou ovlivňovat orientaci mikrotubulů65, mohou být účinky GA na orientaci buněčného dělení zprostředkovány také jinými hormony.
Rané cytologické studie ukázaly, že pro vývoj internodií jsou nezbytné jak vnitřní, tak vnější oblasti SAM Arabidopsis2,42. Skutečnost, že GA aktivně reguluje buněčné dělení ve vnitřních tkáních12, podporuje dvojí funkci GA v regulaci velikosti meristému a internodií v SAM. Vzorec směrového buněčného dělení je také přísně regulován ve vnitřní tkáni SAM a tato regulace je nezbytná pro růst stonku52. Bude zajímavé zkoumat, zda GA hraje také roli v orientaci roviny buněčného dělení ve vnitřní organizaci SAM, a tím synchronizuje specifikaci a vývoj internodií v rámci SAM.
Rostliny byly pěstovány in vitro v půdě nebo v médiu 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) doplněném 1 % sacharózy a 1 % agaru (Sigma) za standardních podmínek (16 h světla, 22 °C), s výjimkou experimentů s hypokotylem a růstem kořenů, ve kterých byly sazenice pěstovány na vertikálních plotnách za konstantního světla a 22 °C. Pro experimenty s dusičnany byly rostliny pěstovány na modifikovaném MS médiu (plant medium bioWORLD) doplněném odpovídajícím množstvím dusičnanů (0 nebo 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinátu, 1 % sacharózy a 1 % A-agaru (Sigma) za podmínek dlouhého dne.
cDNA GID1a vložená do pDONR221 byla rekombinována s pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry do pB7m34GW za vzniku pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 vložená do pDONR221 byla rekombinována do pB7RWG266 za vzniku p35S:IDD2-RFP. Pro generování pGID1b::2xmTQ2-GID1b byl nejprve amplifikován 3,9 kb dlouhý fragment před kódující oblastí GID1b a 4,7 kb dlouhý fragment obsahující cDNA GID1b (1,3 kb) a terminátor (3,4 kb) pomocí primerů v doplňkové tabulce 3 a poté vložen do pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) a pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) v uvedeném pořadí a nakonec rekombinován s pDONR221 2xmTQ268 do cílového vektoru pGreen 012567 pomocí klonování Gateway. Pro generování pCUC2::LSSmOrange byla do vektoru pro cílení kanamycinu pGreen sestavena promotorová sekvence CUC2 (3229 bp proti směru transkripce ATG), následovaná kódující sekvencí velkého Stokesově posunutého mOrange (LSSmOrange)69 s jaderným lokalizačním signálem N7 a transkripčním terminátorem NOS. Rostlinný binární vektor byl zaveden do kmene Agrobacterium tumefaciens GV3101 a do listů Nicotiana benthamiana metodou infiltrace Agrobacterium a do Arabidopsis thaliana Col-0 metodou floral dip. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA byly izolovány z potomků F3 a F1 příslušných křížení.
RNA in situ hybridizace byla provedena na přibližně 1 cm dlouhých špičkách výhonků72, které byly odebrány a okamžitě fixovány v roztoku FAA (3,7% formaldehyd, 5% kyselina octová, 50% ethanol) předem ochlazeném na 4 °C. Po 2 × 15minutovém vakuovém ošetření byl fixátor vyměněn a vzorky byly inkubovány přes noc. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 a RGL3 a antisense sondy k jejich 3'-UTR byly syntetizovány za použití primerů uvedených v doplňkové tabulce 3, jak popsali Rosier et al.73. Digoxigeninem značené sondy byly imunodetekovány pomocí digoxigeninových protilátek (3000násobné ředění; Roche, katalogové číslo: 11 093 274 910) a řezy byly obarveny roztokem 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu (BCIP, 250násobné ředění)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200násobné ředění).
Čas zveřejnění: 10. února 2025