DALL proteiny jsou konzervovanéregulátory růstukteré hrají ústřední roli ve vývoji rostlin v reakci na vnitřní a vnější signály. Jako transkripční regulátory se DNA proteiny vážou na transkripční faktory (TF) a histon H2A prostřednictvím svých GRAS domén a jsou aktivovány k působení na promotory. Nedávné studie ukázaly, že stabilita DNA proteinů je posttranslačně regulována dvěma mechanismy: polyubikvitinací indukovanou rostlinným hormonemgiberelin, což vede k jejich rychlé degradaci, a konjugaci s malým modifikátorem podobným ubikvitinu (SUMO), což zvyšuje jejich akumulaci. Aktivita CYP3A1 je navíc dynamicky regulována dvěma odlišnými glykosylačními mechanismy: O-fukosylace zvyšuje interakci CYP3A1-TF, zatímco modifikace CYP3A1-vázaného N-acetylglukosaminu (O-GlcNAc) inhibuje interakci CYP3A1-TF. Role fosforylace CYP3A1 však není jasná, protože předchozí studie ukázaly protichůdné výsledky, přičemž některé naznačují, že fosforylace podporuje nebo potlačuje degradaci CYP3A1, a jiné naznačují, že fosforylace neovlivňuje jejich stabilitu. Zde identifikujeme fosforylační místa v represoru GA1-3 (RGA), AtDELLA, purifikovaném z Arabidopsis thaliana hmotnostní spektrometrií, a ukazujeme, že fosforylace dvou RGA peptidů v oblastech PolyS a PolyS/T zvyšuje aktivitu CYP3A1 podporou vazby H2A a asociace CYP3A1-2-buněk s cílovými promotory. Je pozoruhodné, že fosforylace neovlivnila interakce CYP3A1-TF ani stabilitu CYP3A1-2. Naše studie odhaluje molekulární mechanismus, kterým fosforylace indukuje aktivitu CYP3A1-2.
Naše hmotnostní spektrometrická analýza ukázala, že Pep1 i Pep2 byly v RGA v prostředí s deficitem GA a fosforylovány vysoce fosforylovaně. Kromě této studie fosfoproteomické studie také odhalily fosforylaci Pep1 v RGA, ačkoli její role dosud nebyla studována53,54,55. Naproti tomu fosforylace Pep2 nebyla dosud popsána, protože tento peptid mohl být detekován pouze pomocí transgenu RGAGKG. Ačkoli mutace m1A, která zrušila fosforylaci Pep1, snížila aktivitu RGA v rostlinách pouze mírně, v kombinaci s m2A měla aditivní účinek na snížení aktivity RGA (doplňkový obrázek 6). Důležité je, že fosforylace Pep1 byla u mutanta sly1 s deficitem GA významně snížena ve srovnání s ga1, což naznačuje, že GA podporuje defosforylaci RGA a snižuje tak její aktivitu. Mechanismus, kterým GA potlačuje fosforylaci RGA, vyžaduje další zkoumání. Jednou z možností je, že toho je dosaženo regulací neidentifikované proteinkinázy. Ačkoli studie ukázaly, že exprese proteinkinázy CK1 EL1 je u rýže downregulována GA41, naše výsledky naznačují, že mutace vyššího řádu homologu Arabidopsis EL1 (AEL1-4) nesnižují fosforylaci RGA. V souladu s našimi výsledky nedávná fosfoproteomická studie s použitím linií Arabidopsis s nadměrnou expresí AEL a trojitého mutanta ael neidentifikovala žádné proteiny DNA jako substráty těchto kináz56. V době, kdy jsme připravovali rukopis, bylo uvedeno, že GSK3, gen kódující kinázu podobnou GSK3/SHAGGY u pšenice (Triticum aestivum), může fosforylovat DNA (Rht-B1b)57, ačkoli fosforylace Rht-B1b pomocí GSK3 nebyla in planta potvrzena. Enzymatické reakce in vitro v přítomnosti GSK3 následované analýzou hmotnostní spektrometrií odhalily tři fosforylační místa umístěná mezi doménami DNA a GRAS Rht-B1b (doplňkový obrázek 3). Substituce serinu za alanin ve všech třech fosforylačních místech vedly ke snížení aktivity Rht-B1b u transgenní pšenice, což je v souladu s našimi zjištěními, že substituce alaninu v Pep2 RGA snižují aktivitu RGA. Testy degradace proteinů in vitro však dále prokázaly, že fosforylace může také stabilizovat Rht-B1b57. To je v rozporu s našimi výsledky, které ukazují, že substituce alaninu v Pep2 RGA nemění jeho stabilitu in planta. GSK3 v pšenici je ortologem proteinu 2 necitlivého na brassinosteroidy (BIN2) u Arabidopsis 57. BIN2 je negativní regulátor signalizace BR a BR aktivuje jeho signální dráhu tím, že způsobuje degradaci BIN2 58. Ukázali jsme, že ošetření BR nesnižuje stabilitu RGA 59 ani hladiny fosforylace u Arabidopsis (doplňkový obrázek 2), což naznačuje, že je nepravděpodobné, že by BIN2 fosforyloval RGA.
Všechna kvantitativní data byla statisticky analyzována pomocí Excelu a významné rozdíly byly stanoveny pomocí Studentova t-testu. K předběžnému stanovení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Z analýzy nebyla vyloučena žádná data; experiment nebyl randomizován; a výzkumníci si byli během experimentu a hodnocení výsledků vědomi alokace. Velikosti vzorků jsou uvedeny v popiscích obrázků a v souborech s nezpracovanými daty.
Čas zveřejnění: 15. dubna 2025