DELLA proteiny jsou konzervovanéregulátory růstukteré hrají ústřední roli ve vývoji rostlin v reakci na vnitřní a vnější signály. Jako regulátory transkripce se DELLA vážou na transkripční faktory (TF) a histon H2A prostřednictvím svých domén GRAS a jsou rekrutovány, aby působily na promotory. Nedávné studie ukázaly, že stabilita DELLA je regulována posttranslačně dvěma mechanismy: polyubikvitinací vyvolanou rostlinným hormonemgiberelin, což vede k jejich rychlé degradaci, a konjugaci s malým modifikátorem podobným ubiquitinu (SUMO), který zvyšuje jejich akumulaci. Kromě toho je aktivita DELLA dynamicky regulována dvěma odlišnými glykosylačními mechanismy: O-fukosylace zvyšuje interakci DELLA-TF, zatímco modifikace O-vázaného N-acetylglukosaminu (O-GlcNAc) inhibuje interakci DELLA-TF. Role fosforylace DELLA je však nejasná, protože předchozí studie ukázaly protichůdné výsledky, přičemž některé naznačují, že fosforylace podporuje nebo potlačuje degradaci DELLA a jiné naznačují, že fosforylace neovlivňuje jejich stabilitu. Zde identifikujeme fosforylační místa v represoru GA1-3 (RGA), AtDELLA, purifikovaném z Arabidopsis thaliana hmotnostní spektrometrií a ukazujeme, že fosforylace dvou RGA peptidů v oblastech PolyS a PolyS/T zvyšuje aktivitu RGA podporou vazby H2A a asociace RGA s cílovými promotory. Je pozoruhodné, že fosforylace neovlivnila interakce RGA-TF ani stabilitu RGA. Naše studie odhaluje molekulární mechanismus, kterým fosforylace indukuje aktivitu DELLA.
Naše hmotnostní spektrometrická analýza odhalila, že Pep1 i Pep2 byly vysoce fosforylovány v RGA na pozadí Gal s deficitem GA. Kromě této studie odhalily fosfoproteomické studie také fosforylaci Pep1 v RGA, ačkoli její role dosud nebyla studována53,54,55. Naproti tomu fosforylace Pep2 nebyla dříve popsána, protože tento peptid mohl být detekován pouze pomocí transgenu RGAGKG. Ačkoli mutace m1A, která zrušila fosforylaci Pep1, pouze mírně snížila aktivitu RGA v planta, měla aditivní účinek v kombinaci s m2A při snižování aktivity RGA (doplňkový obrázek 6). Důležité je, že fosforylace Pep1 byla významně snížena v mutantě sly1 se zesíleným GA ve srovnání s gal, což naznačuje, že GA podporuje defosforylaci RGA a snižuje její aktivitu. Mechanismus, kterým GA potlačuje fosforylaci RGA, vyžaduje další zkoumání. Jednou z možností je, že toho je dosaženo regulací neidentifikované proteinkinázy. Ačkoli studie ukázaly, že exprese CK1 proteinkinázy EL1 je downregulována GA v rýži41, naše výsledky ukazují, že mutace vyššího řádu homologu Arabidopsis EL1 (AEL1-4) nesnižují fosforylaci RGA. V souladu s našimi výsledky nedávná fosfoproteomická studie využívající Arabidopsis AEL nadměrně exprimující linie a trojitý mutant ael neidentifikovala žádné DELLA proteiny jako substráty těchto kináz56. Když jsme připravovali rukopis, bylo oznámeno, že GSK3, gen kódující kinázu podobnou GSK3/SHAGGY v pšenici (Triticum aestivum), může fosforylovat DELLA (Rht-B1b)57, ačkoli fosforylace Rht-B1b pomocí GSK3 nebyla u rostlin potvrzena. In vitro enzymatické reakce v přítomnosti GSK3 následované analýzou hmotnostní spektrometrií odhalily tři fosforylační místa umístěná mezi doménami DELLA a GRAS Rht-B1b (doplňkový obrázek 3). Substituce serinu za alanin na všech třech fosforylačních místech vedly ke snížení aktivity Rht-B1b v transgenní pšenici, což je v souladu s našimi zjištěními, že substituce alaninu v Pep2 RGA snížily aktivitu RGA. Testy degradace proteinů in vitro však dále ukázaly, že fosforylace může také stabilizovat Rht-B1b57. To je v kontrastu s našimi výsledky, které ukazují, že substituce alaninu v Pep2 RGA nemění jeho stabilitu v planta. GSK3 v pšenici je ortolog proteinu 2 necitlivého na brassinosteroidy (BIN2) v Arabidopsis 57. BIN2 je negativní regulátor signalizace BR a BR aktivuje svou signální dráhu tím, že způsobí degradaci BIN2 58. Ukázali jsme, že léčba BR nesnižuje stabilitu RGA 59 nebo fosforylaci na rozdíl od hladiny fosforylace v Arabidopsis na obrázku být fosforylován BIN2.
Všechna kvantitativní data byla statisticky analyzována pomocí Excelu a významné rozdíly byly stanoveny pomocí Studentova t-testu. Pro předběžné stanovení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Z analýzy nebyla vyloučena žádná data; experiment nebyl náhodný; a výzkumníci si byli vědomi alokace během experimentu a hodnocení výsledku. Velikosti vzorků jsou uvedeny v legendách obrázků a v souborech nezpracovaných dat.
Čas odeslání: 15. dubna 2025