Fosforylace aktivuje hlavní růstový regulátor DELLA v Arabidopsis podporou asociace histonu H2A s chromatinem.

DELLA proteiny jsou konzervované masterregulátory růstukteré hrají ústřední roli v řízení vývoje rostlin v reakci na vnitřní a environmentální podněty. DELLA působí jako transkripční regulátor a je rekrutován do cílových promotorů vazbou na transkripční faktory (TF) a histon H2A prostřednictvím své GRAS domény. Nedávné studie ukázaly, že stabilita DELLA je posttranslačně regulována prostřednictvím dvou mechanismů: polyubikvitinace indukovaná fytohormonem giberelinem, který vede k jeho rychlé degradaci, a konjugace malých modifikátorů podobných ubiquitinu (SUMO) ke zvýšení jeho akumulace. Kromě toho je aktivita DELLA dynamicky regulována dvěma různými glykosylacemi: interakce DELLA-TF je zesílena O-fukosylací, ale inhibována modifikací O-vázaného N-acetylglukosaminu (O-GlcNAc). Role fosforylace DELLA však zůstává nejasná, protože předchozí studie ukázaly protichůdné výsledky, od těch, které ukazují, že fosforylace podporuje nebo snižuje degradaci DELLA, až po jiné, které ukazují, že fosforylace neovlivňuje její stabilitu. Zde identifikujeme fosforylační místa v REPRESSORUga1-3(RGA, AtDELLA) purifikované z Arabidopsis thaliana analýzou hmotnostní spektrometrie a ukazují, že fosforylace dvou RGA peptidů v oblastech PolyS a PolyS/T podporuje vazbu H2A a zvýšenou aktivitu RGA. Asociace RGA s cílovými promotéry. Je pozoruhodné, že fosforylace neovlivňuje interakce RGA-TF ani stabilitu RGA. Naše studie odhaluje molekulární mechanismus, kterým fosforylace indukuje aktivitu DELLA.
Pro objasnění role fosforylace při regulaci funkce DELLA je zásadní identifikovat fosforylační místa DELLA in vivo a provést funkční analýzy v rostlinách. Afinitní purifikací rostlinných extraktů následovanou MS/MS analýzou jsme identifikovali několik fosfozitů v RGA. Za podmínek deficitu GA se fosforylace RHA zvyšuje, ale fosforylace neovlivňuje její stabilitu. Důležité je, že testy co-IP a ChIP-qPCR odhalily, že fosforylace v oblasti PolyS/T RGA podporuje jeho interakci s H2A a jeho spojení s cílovými promotory, což odhaluje mechanismus, kterým fosforylace indukuje funkci RGA.
RGA se rekrutuje do cílového chromatinu prostřednictvím interakce subdomény LHR1 s TF a poté se váže na H2A prostřednictvím své oblasti PolyS/T a subdomény PFYRE, čímž vytváří komplex H2A-RGA-TF pro stabilizaci RGA. Fosforylace Pep 2 v oblasti PolyS/T mezi doménou DELLA a doménou GRAS neidentifikovanou kinázou zvyšuje vazbu RGA-H2A. Mutantní protein rgam2A ruší fosforylaci RGA a přijímá jinou konformaci proteinu, aby interferoval s vazbou H2A. To má za následek destabilizaci přechodných interakcí TF-rgam2A a disociaci rgam2A z cílového chromatinu. Tento obrázek znázorňuje pouze RGA-zprostředkovanou transkripční represi. Podobný vzorec by mohl být popsán pro aktivaci transkripce zprostředkovanou RGA, kromě toho, že komplex H2A-RGA-TF by podporoval transkripci cílového genu a defosforylace rgam2A by snižovala transkripci. Obrázek upraven z Huang et al.21.
Všechna kvantitativní data byla statisticky analyzována pomocí Excelu a významné rozdíly byly stanoveny pomocí Studentova t testu. Pro předběžné stanovení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Z analýzy nebyla vyloučena žádná data; experiment nebyl náhodný; výzkumníci nebyli slepí k distribuci dat během experimentu a vyhodnocování výsledků. Velikost vzorku je uvedena v legendě obrázku a zdrojovém datovém souboru.
Více informací o designu studie naleznete v abstraktu zprávy o přirozeném portfoliu, který je součástí tohoto článku.
Proteomická data hmotnostní spektrometrie byla poskytnuta konsorciu ProteomeXchange prostřednictvím partnerského úložiště PRIDE66 s identifikátorem datové sady PXD046004. Všechny ostatní údaje získané během této studie jsou uvedeny v doplňkových informacích, doplňkových datových souborech a nezpracovaných datových souborech. Zdrojová data jsou poskytnuta pro tento článek.