Tato studie hodnotila letalitu, subletalitu a toxicitu komerčníchcypermethrinformulace pro pulci bezoblačné. V akutním testu byly testovány koncentrace 100–800 μg/l po dobu 96 hodin. V chronickém testu byly testovány přirozeně se vyskytující koncentrace cypermethrinu (1, 3, 6 a 20 μg/l) na mortalitu, následované testováním mikronukleů a jaderných abnormalit červených krvinek po dobu 7 dnů. LC50 komerční formulace cypermethrinu pro pulci byla 273,41 μg L−1. V chronickém testu vedla nejvyšší koncentrace (20 μg L−1) k více než 50% mortalitě, protože usmrtila polovinu testovaných pulců. Mikronukleový test ukázal významné výsledky při 6 a 20 μg L−1 a bylo detekováno několik jaderných abnormalit, což naznačuje, že komerční formulace cypermethrinu má genotoxický potenciál proti P. gracilis. Cypermethrin představuje pro tento druh vysoké riziko, což naznačuje, že může způsobit řadu problémů a ovlivnit dynamiku tohoto ekosystému v krátkodobém i dlouhodobém horizontu. Lze tedy konstatovat, že komerční formulace cypermethrinu mají toxické účinky na P. gracilis.
Vzhledem k neustálému rozšiřování zemědělských aktivit a intenzivnímu uplatňováníhubení škůdcůopatření jsou vodní živočichové často vystaveni pesticidům1,2. Znečištění vodních zdrojů v blízkosti zemědělských polí může ovlivnit vývoj a přežití necílových organismů, jako jsou obojživelníci.
Obojživelníci se stávají stále důležitějšími při hodnocení environmentálních matric. Obojživelníci jsou považováni za dobré bioindikátory znečišťujících látek v životním prostředí díky svým jedinečným vlastnostem, jako jsou složité životní cykly, rychlý růst larev, trofický stav, propustná kůže10,11, závislost na vodě pro reprodukci12 a nechráněná vajíčka11,13,14. Malá vodní skokan (Physalaemus gracilis), běžně známá jako plačící skokan, se ukázala jako bioindikátor znečištění pesticidy4,5,6,7,15. Tento druh se vyskytuje ve stojatých vodách, chráněných oblastech nebo oblastech s proměnlivým stanovištěm v Argentině, Uruguayi, Paraguayi a Brazílii1617 a podle klasifikace IUCN je považován za stabilní díky svému širokému rozšíření a toleranci k různým stanovištím18.
U obojživelníků byly po expozici cypermethrinu hlášeny subletální účinky, včetně behaviorálních, morfologických a biochemických změn u pulců23,24,25, změněné úmrtnosti a doby metamorfózy, enzymatických změn, snížené úspěšnosti líhnutí24,25, hyperaktivity26, inhibice aktivity cholinesterázy27 a změn v plaveckých schopnostech7,28. Studie genotoxických účinků cypermethrinu u obojživelníků jsou však omezené. Proto je důležité posoudit citlivost druhů beznohých k cypermethrinu.
Znečištění životního prostředí ovlivňuje normální růst a vývoj obojživelníků, ale nejzávažnějším nepříznivým účinkem je genetické poškození DNA způsobené expozicí pesticidům13. Analýza morfologie krevních buněk je důležitým bioindikátorem znečištění a potenciální toxicity látky pro volně žijící druhy29. Mikronukleární test je jednou z nejčastěji používaných metod pro stanovení genotoxicity chemických látek v životním prostředí30. Je to rychlá, účinná a levná metoda, která je dobrým indikátorem chemického znečištění organismů, jako jsou obojživelníci31,32, a může poskytnout informace o expozici genotoxickým polutantům33.
Cílem této studie bylo vyhodnotit toxický potenciál komerčních formulací cypermethrinu pro malé vodní pulci pomocí mikronukleového testu a posouzení ekologického rizika.
Kumulativní úmrtnost (%) pulců druhu P. gracilis vystavených různým koncentracím komerčního cypermethrinu během akutního období testu.
Kumulativní úmrtnost (%) pulců druhu P. gracilis vystavených různým koncentracím komerčního cypermethrinu během chronického testu.
Pozorovaná vysoká úmrtnost byla výsledkem genotoxických účinků u obojživelníků vystavených různým koncentracím cypermethrinu (6 a 20 μg/l), o čemž svědčí přítomnost mikronukleů (MN) a jaderných abnormalit v erytrocytech. Vznik MN naznačuje chyby v mitóze a je spojen se špatnou vazbou chromozomů na mikrotubuly, defekty v proteinových komplexech zodpovědných za příjem a transport chromozomů, chybami v segregaci chromozomů a chybami v opravě poškození DNA38,39 a může souviset s oxidačním stresem vyvolaným pesticidy40,41. Další abnormality byly pozorovány u všech hodnocených koncentrací. Zvyšující se koncentrace cypermethrinu zvýšily jaderné abnormality v erytrocytech o 5 % a 20 % při nejnižší (1 μg/l) a nejvyšší (20 μg/l) dávce. Například změny v DNA druhu mohou mít vážné důsledky pro krátkodobé i dlouhodobé přežití, což vede k poklesu populace, změněné reprodukční zdatnosti, příbuzenskému křížení, ztrátě genetické rozmanitosti a změněné míře migrace. Všechny tyto faktory mohou ovlivnit přežití a udržení druhu42,43. Vznik erytroidních abnormalit může naznačovat blokádu cytokinézy, což vede k abnormálnímu buněčnému dělení (dvojjaderné erytrocyty)44,45; vícelaločná jádra jsou výčnělky jaderné membrány s více laloky46, zatímco jiné erytroidní abnormality mohou být spojeny s amplifikací DNA, jako jsou jaderné ledvinky/bubliny47. Přítomnost anukleovaných erytrocytů může naznačovat zhoršený transport kyslíku, zejména v kontaminované vodě48,49. Apoptóza indikuje buněčnou smrt50.
Další studie také prokázaly genotoxické účinky cypermethrinu. Kabaña a kol.51 prokázali přítomnost mikronukleů a jaderných změn, jako jsou dvojjaderné buňky a apoptotické buňky, v buňkách Odontophrynus americanus po expozici vysokým koncentracím cypermethrinu (5000 a 10 000 μg L−1) po dobu 96 hodin. Apoptóza indukovaná cypermethrinem byla detekována také u P. biligonigerus52 a Rhinella arenarum53. Tyto výsledky naznačují, že cypermethrin má genotoxické účinky na řadu vodních organismů a že test MN a ENA může být indikátorem subletálních účinků na obojživelníky a může být použitelný pro původní druhy a divoké populace vystavené toxinům12.
Komerční formulace cypermethrinu představují vysoké environmentální riziko (akutní i chronické), přičemž HQ překračují úroveň stanovenou Agenturou pro ochranu životního prostředí USA (EPA)54 a mohou nepříznivě ovlivnit daný druh, pokud jsou přítomny v prostředí. V hodnocení chronického rizika byla NOEC pro mortalitu 3 μg L−1, což potvrzuje, že koncentrace zjištěné ve vodě mohou pro daný druh představovat riziko55. Letální NOEC pro larvy R. arenarum vystavené směsi endosulfanu a cypermethrinu byla 500 μg L−1 po 168 hodinách; tato hodnota se po 336 hodinách snížila na 0,0005 μg L−1. Autoři ukazují, že čím delší je expozice, tím nižší jsou koncentrace, které jsou pro daný druh škodlivé. Je také důležité zdůraznit, že hodnoty NOEC byly vyšší než u P. gracilis při stejné době expozice, což naznačuje, že druhová reakce na cypermethrin je druhově specifická. Pokud jde o úmrtnost, hodnota CHQ u P. gracilis po expozici cypermethrinu dosáhla 64,67, což je více než referenční hodnota stanovená Agenturou pro ochranu životního prostředí USA54, a hodnota CHQ u larev R. arenarum byla také vyšší než tato hodnota (CHQ > 388,00 po 336 hodinách), což naznačuje, že studované insekticidy představují vysoké riziko pro několik druhů obojživelníků. Vzhledem k tomu, že P. gracilis potřebuje k dokončení metamorfózy přibližně 30 dní56, lze usoudit, že studované koncentrace cypermethrinu mohou přispívat k poklesu populace tím, že brání infikovaným jedincům ve vstupu do dospělého nebo reprodukčního stádia v raném věku.
V vypočteném hodnocení rizika mikronukleů a dalších abnormalit erytrocytárních jader se hodnoty CHQ pohybovaly v rozmezí od 14,92 do 97,00, což naznačuje, že cypermethrin představuje potenciální genotoxické riziko pro P. gracilis i v jeho přirozeném prostředí. S přihlédnutím k úmrtitě byla maximální koncentrace xenobiotických sloučenin tolerovatelná pro P. gracilis 4,24 μg L−1. Nicméně i koncentrace nízké až 1 μg/L vykazovaly genotoxické účinky. Tato skutečnost může vést ke zvýšení počtu abnormálních jedinců57 a ovlivnit vývoj a reprodukci druhů v jejich stanovištích, což vede k poklesu populací obojživelníků.
Komerční formulace insekticidu cypermethrin vykazovaly vysokou akutní a chronickou toxicitu pro P. gracilis. Byla pozorována vyšší úmrtnost, pravděpodobně v důsledku toxických účinků, o čemž svědčí přítomnost mikronukleů a abnormalit erytrocytových jader, zejména pilovitých jader, laločnatých jader a vezikulárních jader. Studované druhy navíc vykazovaly zvýšená environmentální rizika, a to jak akutní, tak chronická. Tato data v kombinaci s předchozími studiemi naší výzkumné skupiny ukázala, že i různé komerční formulace cypermethrinu stále způsobovaly sníženou aktivitu acetylcholinesterázy (AChE) a butyrylcholinesterázy (BChE) a oxidační stres58 a vedly ke změnám v plavecké aktivitě a orálním malformacím59 u P. gracilis, což naznačuje, že komerční formulace cypermethrinu mají pro tento druh vysokou letální a subletální toxicitu. Hartmann a kol.60 zjistili, že komerční formulace cypermethrinu byly nejtoxičtější pro P. gracilis a další druh stejného rodu (P. cuvieri) ve srovnání s devíti dalšími pesticidy. To naznačuje, že legálně schválené koncentrace cypermethrinu pro ochranu životního prostředí mohou vést k vysoké úmrtnosti a dlouhodobému poklesu populace.
Pro posouzení toxicity pesticidu pro obojživelníky jsou zapotřebí další studie, jelikož koncentrace nalezené v životním prostředí mohou způsobit vysokou úmrtnost a představovat potenciální riziko pro P. gracilis. Výzkum druhů obojživelníků by měl být podporován, jelikož údaje o těchto organismech jsou vzácné, zejména o brazilských druzích.
Test chronické toxicity trval 168 hodin (7 dní) za statických podmínek a subletální koncentrace byly: 1, 3, 6 a 20 μg ai L−1. V obou experimentech bylo hodnoceno 10 pulců na exponovanou skupinu v šesti opakováních, celkem tedy 60 pulců na koncentraci. Experiment s vodou sloužil jako negativní kontrola. Každé experimentální uspořádání sestávalo ze sterilní skleněné misky o objemu 500 ml a hustotě 1 pulec na 50 ml roztoku. Baňka byla zakryta polyethylenovou fólií, aby se zabránilo odpařování, a byla průběžně provzdušňována.
Voda byla chemicky analyzována za účelem stanovení koncentrací pesticidů v čase 0, 96 a 168 hodin. Podle Sabina a kol.68 a Martinse a kol.69 byly analýzy provedeny v Laboratoři pro analýzu pesticidů (LARP) Federální univerzity v Santa Maria za použití plynové chromatografie spojené s trojitou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrií (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornie, USA). Kvantitativní stanovení pesticidů ve vodě je uvedeno jako doplňkový materiál (tabulka SM1).
Pro mikronukleární test (MNT) a test jaderných abnormalit červených krvinek (RNA) bylo analyzováno 15 pulců z každé léčebné skupiny. Pulci byli anestetizováni 5% lidokainem (50 mg g-170) a vzorky krve byly odebrány srdeční punkcí pomocí jednorázových heparinizovaných stříkaček. Krevní nátěry byly připraveny na sterilních mikroskopických podložních sklíčkách, sušeny na vzduchu, fixovány 100% methanolem (4 °C) po dobu 2 minut a poté barveny 10% roztokem Giemsy po dobu 15 minut ve tmě. Na konci procesu byla sklíčka promyta destilovanou vodou, aby se odstranilo přebytečné barvivo, a sušena při pokojové teplotě.
Nejméně 1000 erytrocytů z každého pulce bylo analyzováno pomocí mikroskopu se 100× zvětšením a objektivem 71 za účelem stanovení přítomnosti MN a ENA. Celkem bylo vyhodnoceno 75 796 erytrocytů z pulců s ohledem na koncentrace cypermethrinu a kontroly. Genotoxicita byla analyzována podle metody Carrasca a kol. a Fenecha a kol.38,72 stanovením četnosti následujících jaderných lézí: (1) bezjaderné buňky: buňky bez jader; (2) apoptotické buňky: fragmentace jádra, programovaná buněčná smrt; (3) dvoujaderné buňky: buňky se dvěma jádry; (4) jaderné pupeny nebo buňky váčků: buňky s jádry s malými výčnělky jaderné membrány, váčky podobné velikosti jako mikrojádra; (5) karyolyzované buňky: buňky pouze s obrysem jádra bez vnitřního materiálu; (6) vroubkované buňky: buňky s jádry se zjevnými prasklinami nebo váčky ve tvaru, nazývané také jádra ve tvaru ledviny; (7) laločnaté buňky: buňky s jadernými výběžky většími než výše uvedené vezikuly; a (8) mikrobuňky: buňky s kondenzovanými jádry a redukovanou cytoplazmou. Změny byly porovnány s výsledky negativní kontroly.
Výsledky testů akutní toxicity (LC50) byly analyzovány pomocí softwaru GBasic a metody TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Data z chronických testů byla předem testována na normalitu chyb (Shapiro-Wilks) a homogenitu rozptylu (Bartlett). Výsledky byly analyzovány pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA). Pro porovnání dat mezi sebou byl použit Tukeyho test a pro porovnání dat mezi léčebnou skupinou a negativní kontrolní skupinou Dunnettův test.
Data LOEC a NOEC byla analyzována pomocí Dunnettova testu. Statistické testy byly provedeny pomocí softwaru Statistica 8.0 (StatSoft) s hladinou významnosti 95 % (p < 0,05).
Čas zveřejnění: 13. března 2025