Tato studie hodnotila letalitu, subletalitu a toxicitu komerčních látekcypermethrinformulace pro anuranové pulce. V akutním testu byly po dobu 96 hodin testovány koncentrace 100–800 μg/l. V chronickém testu byly přirozeně se vyskytující koncentrace cypermetrinu (1, 3, 6 a 20 μg/l) testovány na mortalitu, poté následovalo mikronukleární testování a jaderné abnormality červených krvinek po dobu 7 dnů. LC50 komerční formulace cypermetrinu pro pulce byla 273,41 μg L−1. V chronickém testu vedla nejvyšší koncentrace (20 μg L−1) k více než 50% úmrtnosti, protože zabila polovinu testovaných pulců. Mikronukleový test ukázal významné výsledky při 6 a 20 μg L−1 a bylo detekováno několik jaderných abnormalit, což naznačuje, že komerční formulace cypermethrinu má genotoxický potenciál proti P. gracilis. Cypermethrin představuje pro tento druh vysoké riziko, což naznačuje, že může způsobit řadu problémů a ovlivnit dynamiku tohoto ekosystému v krátkodobém i dlouhodobém horizontu. Lze tedy učinit závěr, že komerční formulace cypermetrinu mají toxické účinky na P. gracilis.
Vzhledem k neustálému rozšiřování zemědělské činnosti a intenzivní aplikacihubení škůdcůopatření jsou vodní živočichové často vystaveni pesticidům1,2. Znečištění vodních zdrojů v blízkosti zemědělských polí může ovlivnit vývoj a přežití necílových organismů, jako jsou obojživelníci.
Obojživelníci se stávají stále důležitějšími při hodnocení environmentálních matric. Anurany jsou považovány za dobré bioindikátory látek znečišťujících životní prostředí díky svým jedinečným vlastnostem, jako jsou složité životní cykly, rychlá rychlost růstu larev, trofický stav, propustná kůže10,11, závislost na vodě pro reprodukci12 a nechráněná vajíčka11,13,14. Bylo prokázáno, že malá vodní žába (Physalaemus gracilis), běžně známá jako plačka, je bioindikátorem znečištění pesticidy4,5,6,7,15. Tento druh se vyskytuje ve stojatých vodách, chráněných oblastech nebo oblastech s proměnlivým stanovištěm v Argentině, Uruguayi, Paraguayi a Brazílii1617 a je považován za stabilní podle klasifikace IUCN díky své široké distribuci a toleranci k různým biotopům18.
U obojživelníků byly po expozici cypermethrinu hlášeny subletální účinky, včetně behaviorálních, morfologických a biochemických změn u pulců23,24,25, změněná mortalita a doba metamorfózy, enzymatické změny, snížená úspěšnost líhnutí24,25, hyperaktivita26, inhibice aktivity cholinesterázy27,28 změny v plavání. Studie genotoxických účinků cypermethrinu u obojživelníků jsou však omezené. Proto je důležité posoudit citlivost druhů anuranů na cypermethrin.
Znečištění životního prostředí ovlivňuje normální růst a vývoj obojživelníků, ale nejzávažnějším nepříznivým účinkem je genetické poškození DNA způsobené expozicí pesticidům13. Morfologická analýza krevních buněk je důležitým bioindikátorem znečištění a potenciální toxicity látky pro volně žijící druhy29. Mikronukleární test je jednou z nejčastěji používaných metod pro stanovení genotoxicity chemických látek v prostředí30. Je to rychlá, účinná a nenákladná metoda, která je dobrým indikátorem chemického znečištění organismů, jako jsou obojživelníci31,32 a může poskytnout informace o expozici genotoxickým polutantům33.
Cílem této studie bylo vyhodnotit toxický potenciál komerčních přípravků cypermetrinu pro malé vodní pulce pomocí mikronukleárního testu a hodnocení ekologických rizik.
Kumulativní mortalita (%) pulců P. gracilis vystavených různým koncentracím komerčního cypermetrinu během akutního období testu.
Kumulativní mortalita (%) pulců P. gracilis vystavených různým koncentracím komerčního cypermetrinu během chronického testu.
Pozorovaná vysoká mortalita byla důsledkem genotoxických účinků u obojživelníků vystavených různým koncentracím cypermetrinu (6 a 20 μg/l), o čemž svědčí přítomnost mikrojader (MN) a jaderných abnormalit v erytrocytech. Tvorba MN ukazuje na chyby v mitóze a je spojena se špatnou vazbou chromozomů na mikrotubuly, defekty v proteinových komplexech odpovědných za příjem a transport chromozomů, chyby v segregaci chromozomů a chyby při opravě poškození DNA38,39 a může souviset s oxidačním stresem vyvolaným pesticidy40,41. Další abnormality byly pozorovány u všech hodnocených koncentrací. Zvyšující se koncentrace cypermethrinu zvýšily jaderné abnormality v erytrocytech o 5 % a 20 % při nejnižších (1 μg/l) a nejvyšších (20 μg/l) dávkách. Například změny v DNA druhu mohou mít vážné důsledky pro krátkodobé i dlouhodobé přežití, což vede k poklesu populace, změněné reprodukční zdatnosti, inbreedingu, ztrátě genetické diverzity a změně rychlosti migrace. Všechny tyto faktory mohou ovlivnit přežití a zachování druhů42,43. Tvorba erytroidních abnormalit může naznačovat blokádu cytokineze, která vede k abnormálnímu buněčnému dělení (binukleární erytrocyty)44,45; multilaločná jádra jsou výčnělky jaderné membrány s více laloky46, zatímco jiné erytroidní abnormality mohou být spojeny s amplifikací DNA, jako jsou jaderné ledviny/puchýřky47. Přítomnost bezjaderných erytrocytů může indikovat zhoršený transport kyslíku, zejména v kontaminované vodě48,49. Apoptóza indikuje buněčnou smrt50.
Jiné studie také prokázaly genotoxické účinky cypermetrinu. Kabaña et al.51 prokázali přítomnost mikrojader a jaderných změn, jako jsou dvoujaderné buňky a apoptotické buňky v buňkách Odontophrynus americanus po vystavení vysokým koncentracím cypermetrinu (5000 a 10 000 μg L−1) po dobu 96 hodin. Cypermetrinem indukovaná apoptóza byla také detekována u P. biligonigerus52 a Rhinella arenarum53. Tyto výsledky naznačují, že cypermethrin má genotoxické účinky na řadu vodních organismů a že test MN a ENA může být indikátorem subletálních účinků na obojživelníky a může být použitelný na původní druhy a divoké populace vystavené toxickým látkám12.
Komerční formulace cypermetrinu představují vysoké riziko pro životní prostředí (akutní i chronické), přičemž velitelství překračuje úroveň Agentury pro ochranu životního prostředí USA (EPA)54, což může nepříznivě ovlivnit druh, pokud je přítomen v životním prostředí. V hodnocení chronického rizika byla NOEC pro mortalitu 3 μg L−1, což potvrzuje, že koncentrace nalezené ve vodě mohou představovat riziko pro daný druh55. Letální NOEC pro larvy R. arenarum vystavené směsi endosulfanu a cypermethrinu byla 500 μg L−1 po 168 hodinách; tato hodnota se po 336 hodinách snížila na 0,0005 μg L−1. Autoři ukazují, že čím delší je expozice, tím nižší jsou koncentrace, které jsou pro daný druh škodlivé. Je také důležité zdůraznit, že hodnoty NOEC byly vyšší než hodnoty P. gracilis ve stejnou dobu expozice, což naznačuje, že druhová odpověď na cypermethrin je druhově specifická. Dále, pokud jde o úmrtnost, hodnota CHQ P. gracilis po expozici cypermethrinu dosáhla 64,67, což je více než referenční hodnota stanovená Agenturou pro ochranu životního prostředí USA54, a hodnota CHQ larev R. arenarum byla také vyšší než tato hodnota (CHQ > 388,00 po 336 hodinách), což naznačuje, že u některých studovaných druhů insekticidů je vysoké riziko Vzhledem k tomu, že P. gracilis vyžaduje k dokončení metamorfózy přibližně 30 dní56, lze dojít k závěru, že studované koncentrace cypermethrinu mohou přispět k poklesu populace tím, že zabrání infikovaným jedincům vstoupit do dospělého nebo reprodukčního stádia v raném věku.
Ve vypočítaném hodnocení rizika mikrojader a dalších jaderných abnormalit erytrocytů se hodnoty CHQ pohybovaly od 14,92 do 97,00, což naznačuje, že cypermethrin měl potenciální genotoxické riziko pro P. gracilis i v jeho přirozeném prostředí. Při zohlednění mortality byla maximální koncentrace xenobiotických látek tolerovatelná pro P. gracilis 4,24 μg L−1. Nicméně i koncentrace již 1 μg/l vykazovaly genotoxické účinky. Tato skutečnost může vést ke zvýšení počtu abnormálních jedinců57 a ovlivnit vývoj a reprodukci druhů v jejich biotopech, což vede k poklesu populací obojživelníků.
Komerční formulace insekticidu cypermethrin vykazovaly vysokou akutní a chronickou toxicitu pro P. gracilis. Byla pozorována vyšší úmrtnost, pravděpodobně v důsledku toxických účinků, o čemž svědčí přítomnost mikrojader a jaderných abnormalit erytrocytů, zejména vroubkovaná jádra, laločnatá jádra a vezikulární jádra. Studované druhy navíc vykazovaly zvýšená environmentální rizika, akutní i chronická. Tyto údaje v kombinaci s předchozími studiemi naší výzkumné skupiny ukázaly, že i různé komerční formulace cypermethrinu stále způsobovaly snížené aktivity acetylcholinesterázy (AChE) a butyrylcholinesterázy (BChE) a oxidační stres58 a vedly ke změnám v plavecké aktivitě a orálním malformacím59 u P. gracilis, což naznačuje, že komerční formulace cypermethrinu mají vysokou toxicitu pro tento druh lethal. Hartmann a kol. 60 zjistili, že komerční formulace cypermetrinu byly nejtoxičtější pro P. gracilis a další druhy stejného rodu (P. cuvieri) ve srovnání s devíti dalšími pesticidy. To naznačuje, že legálně schválené koncentrace cypermetrinu pro ochranu životního prostředí mohou vést k vysoké úmrtnosti a dlouhodobému poklesu populace.
K posouzení toxicity pesticidu pro obojživelníky jsou zapotřebí další studie, protože koncentrace nalezené v životním prostředí mohou způsobit vysokou úmrtnost a představovat potenciální riziko pro P. gracilis. Výzkum na druzích obojživelníků by měl být podporován, protože údaje o těchto organismech jsou vzácné, zejména o brazilských druzích.
Test chronické toxicity trval 168 h (7 dní) za statických podmínek a subletální koncentrace byly: 1, 3, 6 a 20 μg ai L−1. V obou experimentech bylo hodnoceno 10 pulců na léčebnou skupinu v šesti opakováních, celkem 60 pulců na koncentraci. Mezitím ošetření pouze vodou sloužilo jako negativní kontrola. Každé experimentální uspořádání sestávalo ze sterilní skleněné misky o objemu 500 ml a hustotě 1 pulec na 50 ml roztoku. Baňka byla pokryta polyethylenovou fólií, aby se zabránilo odpařování, a byla nepřetržitě provzdušňována.
Voda byla chemicky analyzována pro stanovení koncentrací pesticidů v 0, 96 a 168 h. Podle Sabina a kol. 68 a Martins a kol. 69, analýzy byly provedeny v Laboratoři pro analýzu pesticidů (LARP) Federální univerzity v Santa Maria pomocí plynové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií s trojitým kvadrupólem (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornie, USA). Kvantitativní stanovení pesticidů ve vodě je uvedeno jako doplňkový materiál (tabulka SM1).
Pro mikronukleový test (MNT) a test jaderné abnormality červených krvinek (RNA) bylo analyzováno 15 pulců z každé léčebné skupiny. Pulci byli anestetizováni 5% lidokainem (50 mg g-170) a vzorky krve byly odebrány srdeční punkcí za použití jednorázových heparinizovaných stříkaček. Krevní nátěry byly připraveny na sterilních mikroskopických sklíčkách, vysušeny na vzduchu, fixovány 100% methanolem (4 °C) po dobu 2 minut a poté barveny 10% roztokem Giemsa po dobu 15 minut ve tmě. Na konci procesu byla sklíčka promyta destilovanou vodou, aby se odstranila přebytečná skvrna, a vysušena při teplotě místnosti.
Alespoň 1000 červených krvinek z každého pulce bylo analyzováno pomocí 100× mikroskopu s objektivem 71, aby se stanovila přítomnost MN a ENA. Celkem bylo hodnoceno 75 796 červených krvinek z pulců s ohledem na koncentrace cypermetrinu a kontroly. Genotoxicita byla analyzována podle metody Carrasco et al. a Fenech et al.38,72 stanovením frekvence následujících jaderných lézí: (1) bezjaderné buňky: buňky bez jader; (2) apoptotické buňky: jaderná fragmentace, programovaná buněčná smrt; (3) dvoujaderné buňky: buňky se dvěma jádry; (4) jaderné pupeny nebo puchýřkové buňky: buňky s jádry s malými výběžky jaderné membrány, puchýřky podobné velikosti jako mikrojádra; (5) karyolyzované buňky: buňky pouze s obrysem jádra bez vnitřního materiálu; (6) vroubkované buňky: buňky s jádry se zjevnými prasklinami nebo zářezy ve tvaru, nazývané také ledvinovitá jádra; (7) laločnaté buňky: buňky s jadernými výběžky většími než výše uvedené vezikuly; a (8) mikrobuňky: buňky s kondenzovanými jádry a redukovanou cytoplazmou. Změny byly porovnány s výsledky negativní kontroly.
Výsledky testu akutní toxicity (LC50) byly analyzovány pomocí softwaru GBasic a metody TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Data chronického testu byla předem testována na normalitu chyby (Shapiro-Wilks) a homogenitu rozptylu (Bartlett). Výsledky byly analyzovány pomocí jednocestné analýzy rozptylu (ANOVA). Tukeyův test byl použit k porovnání dat mezi sebou a Dunnettův test byl použit k porovnání dat mezi léčenou skupinou a negativní kontrolní skupinou.
Údaje LOEC a NOEC byly analyzovány pomocí Dunnettova testu. Statistické testy byly provedeny pomocí softwaru Statistica 8.0 (StatSoft) s hladinou významnosti 95 % (p < 0,05).
Čas odeslání: 13. března 2025