Hlístice borová je karanténní migrující endoparazit, o kterém je známo, že způsobuje vážné ekonomické ztráty v ekosystémech borových lesů. Tato studie se zabývá nematicidní aktivitou halogenovaných indolů proti hlísticím borovým a mechanismem jejich účinku. Nematicidní aktivita 5-jodindolu a avermektinu (pozitivní kontrola) proti hlísticím borovým byla podobná a vysoká při nízkých koncentracích (10 μg/ml). 5-jodindol snižoval plodnost, reprodukční aktivitu, embryonální a larvální úmrtnost a lokomotorické chování. Molekulární interakce ligandů s receptory chloridových kanálů řízených glutamátem specifickými pro bezobratlé podporují myšlenku, že 5-jodindol se stejně jako avermektin pevně váže na aktivní místo receptoru. 5-jodindol také indukoval různé fenotypové deformace u hlístic, včetně abnormálního kolapsu/smršťování orgánů a zvýšené vakuolizace. Tyto výsledky naznačují, že vakuoly mohou hrát roli v úmrtí hlístic zprostředkované metylací. Důležité je, že 5-jodindol nebyl toxický pro oba druhy rostlin (zelí a ředkvičky). Tato studie tedy ukazuje, že aplikace jodoindolu za environmentálních podmínek může kontrolovat poškození borovice vadnutím.
Hlístice borová (Bursaphelenchus xylophilus) patří k hlísticím borovým (PWN), migrujícím endoparazitickým hlísticím, o nichž je známo, že způsobují vážné ekologické škody na ekosystémech borových lesů1. Vadnutí borovic (PWD) způsobené hlísticí borovicovou se stává vážným problémem na několika kontinentech, včetně Asie a Evropy, a v Severní Americe hlístice ničí introdukované druhy borovic1,2. Úbytek borovic je závažným ekonomickým problémem a vyhlídky na její globální šíření jsou znepokojivé3. Hlístice nejčastěji napadá tyto druhy borovic: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii a Pinus radiata4. Hlístice borová je závažné onemocnění, které může borovice zahubit během týdnů nebo měsíců od infekce. Kromě toho jsou ohniska výskytu hlístice borové běžná v různých ekosystémech, takže byly vytvořeny přetrvávající infekční řetězce1.
Bursaphelenchus xylophilus je karanténní rostlinný parazitický hlístic patřící do nadčeledi Aphelenchoidea a kladu 102.5. Hlístic se živí houbami a rozmnožuje se v dřevěných tkáních borovic, kde se vyvíjí do čtyř různých larválních stádií: L1, L2, L3, L4 a dospělého jedince1,6. Za podmínek nedostatku potravy přechází borové hlístice do specializovaného larválního stádia – daueru, které parazituje na svém přenašeči – lýkožroutovi borovém (Monochamus alternatus) a je přenášena na zdravé borovice. U zdravých hostitelů hlístice rychle migrují rostlinnými tkáněmi a živí se parenchymatózními buňkami, což vede k řadě hypersenzitivních reakcí, vadnutí borovice a jejímu úhynu do jednoho roku po infekci1,7,8.
Biologická kontrola hlístic borových je již dlouho výzvou, přičemž karanténní opatření sahají až do 20. století. Současné strategie pro kontrolu hlístic borových zahrnují především chemické ošetření, včetně fumigace dřeva a implantace nematicidů do kmenů stromů. Nejčastěji používanými nematicidy jsou avermektin a avermektin benzoát, které patří do čeledi avermektinů. Tyto drahé chemikálie jsou vysoce účinné proti mnoha druhům hlístic a jsou považovány za bezpečné pro životní prostředí9. Očekává se však, že opakované používání těchto nematicidů vytvoří selekční tlak, který téměř jistě povede ke vzniku rezistentních hlístic borových, jak bylo prokázáno u několika hmyzích škůdců, jako jsou Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella a hlístice Trichostrongylus colubriformis a Ostertagia circumcincta, které si postupně vyvinuly rezistenci vůči avermektinům10,11,12. Proto je třeba pravidelně studovat vzorce rezistence a nematicidy průběžně screenovat, aby se našla alternativní, nákladově efektivní a ekologicky šetrná opatření ke kontrole PVD. V posledních desetiletích řada autorů navrhla použití rostlinných extraktů, esenciálních olejů a těkavých látek jako prostředků pro hubení hlístic13,14,15,16.
Nedávno jsme u Caenorhabditis elegans prokázali nematicidní aktivitu indolu, mezibuněčné a meziříšní signální molekuly. Indol je rozšířený intracelulární signál v mikrobiální ekologii, který řídí řadu funkcí ovlivňujících mikrobiální fyziologii, tvorbu spor, stabilitu plazmidů, rezistenci na léky, tvorbu biofilmu a virulenci. 18, 19. Aktivita indolu a jeho derivátů proti jiným patogenním hlísticím nebyla dosud studována. V této studii jsme zkoumali nematicidní aktivitu 34 indolů proti hlísticím borovým a objasnili mechanismus účinku nejúčinnějšího 5-jodindolu pomocí mikroskopie, časosběrného fotografování a molekulárních dokovacích experimentů a posoudili jeho toxické účinky na rostliny pomocí testu klíčení semen.
Vysoké koncentrace (>1,0 mM) indolu byly dříve popsány jako nematocidní účinek na hlístice17. Po ošetření B. xylophilus (smíšená životní stádia) indolem nebo 33 různými deriváty indolu v koncentraci 1 mM byla mortalita B. xylophilus měřena spočítáním živých a mrtvých hlístic v kontrolní a ošetřené skupině. Pět indolů vykazovalo významnou nematocidní aktivitu; přežití neošetřené kontrolní skupiny bylo po 24 hodinách 95 ± 7 %. Z 34 testovaných indolů způsobily 5-jodindol a 4-fluorindol v koncentraci 1 mM 100% mortalitu, zatímco 5,6-difluorindigo, methylindol-7-karboxylát a 7-jodindol způsobily přibližně 50% mortalitu (tabulka 1).
Vliv 5-jodindolu na tvorbu vakuol a metabolismus hlístice borovicové. (A) Vliv avermektinu a 5-jodindolu na dospělé samce hlístic, (B) vajíčka hlístice ve stádiu L1 a (C) metabolismus B. xylophilus, (i) vakuoly nebyly pozorovány v čase 0 hodin, ošetření vedlo k (ii) vakuolám, (iii) akumulaci více vakuol, (iv) zvětšení vakuol, (v) splynutí vakuol a (vi) tvorbě obřích vakuol. Červené šipky označují zvětšení vakuol, modré šipky označují splynutí vakuol a černé šipky označují obří vakuoly. Měřítko = 50 μm.
Tato studie dále popsala postupný proces úmrtí vyvolaného metanem u hlístic borových (obrázek 4C). Methanogenní smrt je neapoptotický typ buněčné smrti spojený s akumulací prominentních cytoplazmatických vakuol27. Morfologické defekty pozorované u hlístic borových se zdají úzce souviset s mechanismem úmrtí vyvolaného metanem. Mikroskopické vyšetření v různých časech ukázalo, že po 20 hodinách expozice 5-jodindolu (0,1 mM) se vytvořily obří vakuoly. Mikroskopické vakuoly byly pozorovány po 8 hodinách ošetření a jejich počet se zvýšil po 12 hodinách. Po 14 hodinách bylo pozorováno několik velkých vakuol. Po 12–16 hodinách ošetření bylo jasně viditelných několik srostlých vakuol, což naznačuje, že základem mechanismu methanogenní smrti je fúze vakuol. Po 20 hodinách bylo v celém červu nalezeno několik obřích vakuol. Tato pozorování představují první zprávu o metuóze u C. elegans.
U červů ošetřených 5-jodindolem byla také pozorována agregace a ruptura vakuol (obr. 5), což dokazuje ohýbání červů a uvolňování vakuol do prostředí. Narušení vakuol bylo pozorováno také v membráně vaječné skořápky, která je normálně během líhnutí zachována neporušená proteinem L2 (doplňkový obr. S2). Tato pozorování podporují zapojení akumulace tekutiny a selhání osmoregulace, stejně jako reverzibilního poškození buněk (RCI), do procesu tvorby a hnisání vakuol (obr. 5).
S hypotézou o roli jódu v pozorované tvorbě vakuol jsme zkoumali nematicidní aktivitu jodidu sodného (NaI) a jodidu draselného (KI). Nicméně v koncentracích (0,1, 0,5 nebo 1 mM) neovlivnily ani přežití hlístic, ani tvorbu vakuol (doplňkový obrázek S5), ačkoli 1 mM KI měl mírný nematicidní účinek. Na druhou stranu, 7-jodindol (1 nebo 2 mM), stejně jako 5-jodindol, indukoval mnohočetné vakuoly a strukturální deformace (doplňkový obrázek S6). Oba jodindoly vykazovaly u hlístic borových podobné fenotypové vlastnosti, zatímco NaI a KI nikoli. Je zajímavé, že indol v testovaných koncentracích neindukoval tvorbu vakuol u B. xylophilus (data nejsou uvedena). Výsledky tedy potvrdily, že za vakuolizaci a metabolismus B. xylophilus je zodpovědný komplex indol-jód.
Mezi indoly testovanými na nematocidní aktivitu měl 5-jodindol nejvyšší index skluzu -5,89 kcal/mol, následovaný 7-jodindolem (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindolem (-4,33) a indolem (-4,03) (obrázek 6). Silná vodíková vazba 5-jodindolu s leucinem 218 stabilizuje jeho vazbu, zatímco všechny ostatní deriváty indolu se vážou na serin 260 prostřednictvím vodíkových vazeb v postranním řetězci. Mezi dalšími modelovanými jodoindoly má 2-jodoindol vazebnou hodnotu -5,248 kcal/mol, což je způsobeno jeho hlavní vodíkovou vazbou s leucinem 218. Mezi další známé vazby patří 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) a 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (doplňkový obrázek S8). Většina halogenovaných indolů a samotný indol, s výjimkou 5-jodindolu a 2-jodindolu, tvoří vazbu se serinem 260. Skutečnost, že vodíková vazba s leucinem 218 svědčí o účinné vazbě receptor-ligand, jak bylo pozorováno u ivermektinu (doplňkový obrázek S7), potvrzuje, že 5-jodindol a 2-jodindol, stejně jako ivermektin, se pevně vážou na aktivní místo receptoru GluCL prostřednictvím leucinu 218 (obr. 6 a doplňkový obrázek S8). Předpokládáme, že tato vazba je nezbytná pro udržení otevřené pórovité struktury komplexu GluCL a že pevnou vazbou na aktivní místo receptoru GluCL 5-jodindol, 2-jodindol, avermektin a ivermektin tak udržují iontový kanál otevřený a umožňují příjem tekutin.
Molekulární dokování indolu a halogenovaného indolu k GluCL. Vazebné orientace ligandů (A) indolu, (B) 4-fluorindolu, (C) 7-jodindolu a (D) 5-jodindolu k aktivnímu místu GluCL. Protein je znázorněn stuhou a vodíkové vazby v hlavním řetězci jsou znázorněny žlutými tečkovanými čarami. (A′), (B′), (C′) a (D′) ukazují interakce odpovídajících ligandů s okolními aminokyselinovými zbytky a vodíkové vazby v postranních řetězcích jsou označeny růžovými tečkovanými šipkami.
Byly provedeny experimenty s cílem vyhodnotit toxický účinek 5-jodindolu na klíčení semen zelí a ředkviček. 5-jodindol (0,05 nebo 0,1 mM) nebo avermektin (10 μg/ml) měly malý nebo žádný vliv na počáteční klíčení a vzcházení rostlinek (obrázek 7). Kromě toho nebyl zjištěn žádný významný rozdíl mezi mírou klíčení neošetřených kontrol a semen ošetřených 5-jodindolu nebo avermektinem. Vliv na prodloužení kůlového kořene a počet vytvořených postranních kořenů byl nevýznamný, ačkoli 1 mM (10násobek jeho aktivní koncentrace) 5-jodindolu mírně zpozdil vývoj postranních kořenů. Tyto výsledky naznačují, že 5-jodindol je netoxický pro rostlinné buňky a při studovaných koncentracích neinterferuje s procesy vývoje rostlin.
Vliv 5-jodindolu na klíčení semen. Klíčení, rašení a boční zakořeňování semen B. oleracea a R. raphanistrum na agarovém médiu Murashige a Skoog s avermektinem nebo 5-jodindolu nebo bez nich. Klíčení bylo zaznamenáno po 3 dnech inkubace při 22 °C.
Tato studie uvádí několik případů usmrcování hlístic indoly. Důležité je, že se jedná o první zprávu o tom, že jodoindol indukuje methylaci (proces způsobený hromaděním malých vakuol, které se postupně slévají do obrovských vakuol, což nakonec vede k prasknutí membrány a jejímu odumření) v jehličí borovice, přičemž jodoindol vykazuje významné nematicidní vlastnosti podobné vlastnostem komerčního nematicidu avermektinu.
Dříve bylo popsáno, že indoly vykonávají u prokaryot a eukaryot řadu signálních funkcí, včetně inhibice/tvorby biofilmu, přežití bakterií a patogenity19,32,33,34. V poslední době přitahují rozsáhlý výzkumný zájem potenciální terapeutické účinky halogenovaných indolů, indolových alkaloidů a polosyntetických derivátů indolu35,36,37. Například bylo prokázáno, že halogenované indoly ničí perzistentní buňky Escherichia coli a Staphylococcus aureus37. Kromě toho je vědecky zajímavé studovat účinnost halogenovaných indolů proti jiným druhům, rodům a říším a tato studie je krokem k dosažení tohoto cíle.
Zde navrhujeme mechanismus pro 5-jodindolem indukovanou letalitu u C. elegans založený na reverzibilním poškození buněk (RCI) a methylaci (obrázky 4C a 5). Edematózní změny, jako je otok a vakuolární degenerace, jsou indikátory RCI a methylace, projevující se jako obrovské vakuoly v cytoplazmě48,49. RCI narušuje produkci energie snížením produkce ATP, což způsobuje selhání ATPázové pumpy nebo narušuje buněčné membrány a způsobuje rychlý přítok Na+, Ca2+ a vody50,51,52. Intracytoplazmatické vakuoly vznikají v živočišných buňkách v důsledku akumulace tekutiny v cytoplazmě v důsledku přítoku Ca2+ a vody53. Je zajímavé, že tento mechanismus poškození buněk je reverzibilní, pokud je poškození dočasné a buňky začnou produkovat ATP po určitou dobu, ale pokud poškození přetrvává nebo se zhoršuje, buňky umírají.54 Naše pozorování ukazují, že hlístice ošetřené 5-jodindolem nejsou schopny obnovit normální biosyntézu po vystavení stresovým podmínkám.
Metylační fenotyp indukovaný 5-jodindolem u B. xylophilus může být způsoben přítomností jódu a jeho molekulární distribucí, protože 7-jodindol měl na B. xylophilus menší inhibiční účinek než 5-jodindol (tabulka 1 a doplňkový obrázek S6). Tyto výsledky jsou částečně v souladu se studiemi Maltese a kol. (2014), kteří uvedli, že translokace pyridylového dusíkatého zbytek v indolu z para- do meta- polohy zrušila vakuolizaci, inhibici růstu a cytotoxicitu v buňkách U251, což naznačuje, že interakce molekuly se specifickým aktivním místem v proteinu je kritická27,44,45. Interakce mezi indolem nebo halogenovanými indoly a receptory GluCL pozorované v této studii také tuto myšlenku podporují, protože bylo zjištěno, že 5- a 2-jodindol se vážou na receptory GluCL silněji než ostatní zkoumané indoly (obrázek 6 a doplňkový obrázek S8). Bylo zjištěno, že jod na druhé nebo páté pozici indolu se váže na leucin 218 receptoru GluCL prostřednictvím vodíkových vazeb v hlavním řetězci, zatímco jiné halogenované indoly a samotný indol tvoří slabé vodíkové vazby v postranním řetězci se serinem 260 (obrázek 6). Proto spekulujeme, že lokalizace halogenu hraje důležitou roli v indukci vakuolární degenerace, zatímco pevná vazba 5-jodindolu udržuje iontový kanál otevřený, což umožňuje rychlý přítok tekutiny a prasknutí vakuoly. Detailní mechanismus účinku 5-jodindolu však stále není znám.
Před praktickým použitím 5-jodindolu je třeba analyzovat jeho toxický účinek na rostliny. Naše experimenty s klíčením semen ukázaly, že 5-jodindol neměl při studovaných koncentracích žádný negativní vliv na klíčení semen ani na následné vývojové procesy (obrázek 7). Tato studie tedy poskytuje základ pro použití 5-jodindolu v ekologickém prostředí ke kontrole škodlivosti hlístic borových pro borovice.
Předchozí zprávy prokázaly, že terapie na bázi indolu představuje potenciální přístup k řešení problému antibiotické rezistence a progrese rakoviny55. Kromě toho mají indoly antibakteriální, protirakovinné, antioxidační, protizánětlivé, antidiabetické, antivirové, antiproliferativní a antituberkulózní účinky a mohou sloužit jako slibný základ pro vývoj léčiv56,57. Tato studie poprvé naznačuje potenciální využití jódu jako antiparazitika a antihelmintika.
Avermektin byl objeven před třemi desetiletími a v roce 2015 získal Nobelovu cenu a jeho používání jako antihelmintika stále aktivně probíhá. Vzhledem k rychlému rozvoji rezistence vůči avermektinům u hlístic a hmyzích škůdců je však zapotřebí alternativní, nízkonákladová a ekologická strategie pro kontrolu infekce borovic háďatkem. Tato studie také uvádí mechanismus, kterým 5-jodindol hubí hlístice borovicové, a skutečnost, že 5-jodindol má nízkou toxicitu pro rostlinné buňky, což otevírá dobré vyhlídky pro jeho budoucí komerční využití.
Všechny experimenty byly schváleny etickou komisí Univerzity Yeungnam v Gyeongsanu v Koreji a metody byly provedeny v souladu s pokyny Etické komise Univerzity Yeungnam.
Experimenty s inkubací vajec byly provedeny za použití zavedených postupů43. Pro posouzení míry líhnutí (HR) byli 1 den starí dospělí hlístice (přibližně 100 samic a 100 samců) přeneseni do Petriho misek obsahujících houbu a ponecháni růst po dobu 24 hodin. Vajíčka byla poté izolována a ošetřena 5-jodindolem (0,05 mM a 0,1 mM) nebo avermektinem (10 μg/ml) ve formě suspenze ve sterilní destilované vodě. Tyto suspenze (500 μl; přibližně 100 vajíček) byly přeneseny do jamek 24jamkové destičky pro tkáňové kultury a inkubovány při 22 °C. Po 24 hodinách inkubace byly provedeny počty L2, ale byly považovány za mrtvé, pokud se buňky při stimulaci jemným platinovým drátkem nepohnuly. Tento experiment byl proveden ve dvou fázích, každá se šesti opakováními. Data z obou experimentů byla sloučena a prezentována. Procento HR se vypočítá následovně:
Mortalita larev byla hodnocena pomocí dříve vyvinutých postupů. Vajíčka hlístic byla odebrána a embrya byla synchronizována líhnutím ve sterilní destilované vodě za účelem generace larev ve stádiu L2. Synchronizované larvy (přibližně 500 hlístic) byly ošetřeny 5-jodindolem (0,05 mM a 0,1 mM) nebo avermektinem (10 μg/ml) a chovány na Petriho miskách s B. cinerea. Po 48 hodinách inkubace při 22 °C byly hlístice odebrány ve sterilní destilované vodě a vyšetřeny na přítomnost stádií L2, L3 a L4. Přítomnost stádií L3 a L4 indikovala larvální transformaci, zatímco přítomnost stádia L2 neindikovala žádnou transformaci. Snímky byly pořízeny pomocí systému iRiS™ Digital Cell Imaging System. Tento experiment byl proveden ve dvou fázích, každá se šesti opakováními. Data z obou experimentů byla sloučena a prezentována.
Toxicita 5-jodindolu a avermektinu pro semena byla hodnocena pomocí klíčivých testů na agarových plotnách Murashige a Skoog.62 Semena B. oleracea a R. raphanistrum byla nejprve namočena na jeden den do sterilní destilované vody, promyta 1 ml 100% ethanolu, sterilizována 1 ml 50% komerčního bělidla (3% chlornan sodný) po dobu 15 minut a pětkrát promyta 1 ml sterilní vody. Sterilizovaná semena byla poté nanesena na klíčicí agarové plotny obsahující 0,86 g/l (0,2X) média Murashige a Skoog a 0,7% bakteriologického agaru s 5-jodindolu nebo avermektinu nebo bez nich. Plotny byly poté inkubovány při 22 °C a snímky byly pořízeny po 3 dnech inkubace. Tento experiment byl proveden ve dvou fázích, z nichž každá měla šest opakování.
Čas zveřejnění: 26. února 2025