Háďátko borovicové je karanténní migrační endoparazit, o kterém je známo, že způsobuje vážné ekonomické ztráty v ekosystémech borovicových lesů. Tato studie shrnuje nematocidní aktivitu halogenovaných indolů proti háďátkům borovicovým a jejich mechanismus účinku. Nematocidní účinky 5-jodindolu a avermektinu (pozitivní kontrola) proti háďátkům borovicovým byly podobné a vysoké při nízkých koncentracích (10 μg/ml). 5-Jodindol snižoval plodnost, reprodukční aktivitu, embryonální a larvální mortalitu a lokomotorické chování. Molekulární interakce ligandů s receptory chloridového kanálu s glutamátem specifickým pro bezobratlé podporují názor, že 5-jodindol se podobně jako avermektin pevně váže na aktivní místo receptoru. 5-Jodindol také vyvolal různé fenotypové deformace u nematodů, včetně abnormálního kolapsu/smrštění orgánů a zvýšené vakuolizace. Tyto výsledky naznačují, že vakuoly mohou hrát roli při smrti zprostředkované methylací nematod. Důležité je, že 5-jodindol byl netoxický pro oba druhy rostlin (zelí a ředkvičky). Tato studie tedy prokazuje, že aplikace jodoindolu v podmínkách prostředí může kontrolovat poškození vadnutím borovice.
Háďátko borové (Bursaphelenchus xylophilus) patří k háďátkům borovým (PWN), stěhovavým endoparazitickým háďátkům, o kterých je známo, že způsobují vážné ekologické škody na ekosystémech borových lesů1. Choroba vadnutí borovice (PWD) způsobená háďátkem borovicovým se stává vážným problémem na několika kontinentech, včetně Asie a Evropy, a v Severní Americe ničí háďátko zavlečené druhy borovic1,2. Úbytek borovic je velkým ekonomickým problémem a vyhlídka na jeho celosvětové rozšíření je znepokojivá3. Háďátko nejčastěji napadá následující druhy borovic: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii a Pinus radiata4. Háďátko borovicové je závažné onemocnění, které může zabít borovice během týdnů nebo měsíců od infekce. Ohniska háďátka borovicového jsou navíc běžná v různých ekosystémech, takže byly vytvořeny trvalé infekční řetězce1.
Bursaphelenchus xylophilus je karanténní rostlinně parazitující háďátko patřící do nadčeledi Aphelenchoidea a kladu 102.5. Háďátko se živí houbami a rozmnožuje se v tkáních dřeva borovic, přičemž se vyvíjí do čtyř různých larválních stádií: L1, L2, L3, L4 a dospělý jedinec1,6. V podmínkách nedostatku potravy přechází háďátko borovicové do specializovaného larválního stadia – dauera, které parazituje na svém přenašeči – kůrovci borovém (Monochamus alternatus) a přenáší se na zdravé borovice. U zdravých hostitelů háďátka rychle migrují rostlinnými pletivy a živí se parenchymatózními buňkami, což vede k řadě hypersenzitivních reakcí, vadnutí borovice a smrti do jednoho roku po infekci1,7,8.
Biologická kontrola háďátek borovicových byla dlouhou dobu výzvou, přičemž karanténní opatření sahají až do 20. století. Současné strategie kontroly háďátek borovicových primárně zahrnují chemické ošetření, včetně fumigace dřeva a implantace nematocidů do kmenů stromů. Nejčastěji používanými nematocidy jsou avermektin a avermektin benzoát, které patří do rodiny avermektinů. Tyto drahé chemikálie jsou vysoce účinné proti mnoha druhům háďátek a jsou považovány za bezpečné pro životní prostředí9. Očekává se však, že opakované používání těchto nematocidů vytvoří selekční tlak, který téměř jistě povede ke vzniku rezistentních háďátek borovicových, jak bylo prokázáno u několika hmyzích škůdců, jako jsou Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella a háďátka Trichostrongylus colubriformis a Ostertagia circumcincta, u kterých se postupně vyvinula odolnost vůči avermectins1,10. Proto je třeba pravidelně studovat vzorce rezistence a neustále prověřovat nematocidy, aby se našly alternativní, nákladově efektivní a ekologická opatření pro kontrolu PVD. V posledních desetiletích řada autorů navrhla použití rostlinných extraktů, esenciálních olejů a těkavých látek jako činidel pro hubení háďátek13,14,15,16.
Nedávno jsme prokázali nematocidní aktivitu indolu, mezibuněčné a mezikrálovské signální molekuly, u Caenorhabditis elegans 17 . Indol je rozšířený intracelulární signál v mikrobiální ekologii, který řídí četné funkce, které ovlivňují mikrobiální fyziologii, tvorbu spor, stabilitu plazmidu, rezistenci vůči lékům, tvorbu biofilmu a virulenci18, 19 . Aktivita indolu a jeho derivátů proti jiným patogenním háďátkům nebyla studována. V této studii jsme zkoumali nematocidní aktivitu 34 indolů proti háďátkům borovicovým a objasnili jsme mechanismus účinku nejúčinnějšího 5-jodindolu pomocí mikroskopie, časosběrné fotografie a experimentů s molekulárním dokováním a hodnotili jsme jeho toxické účinky na rostliny pomocí testu klíčení semen.
Již dříve bylo hlášeno, že vysoké koncentrace (>1,0 mM) indolu mají nematocidní účinek na háďátka17. Po ošetření B. xylophilus (smíšená životní stádia) indolem nebo 33 různými deriváty indolu v 1 mM byla úmrtnost B. xylophilus měřena počítáním živých a mrtvých háďátek v kontrolní a léčené skupině. Pět indolů vykazovalo významnou nematocidní aktivitu; přežití neléčené kontrolní skupiny bylo 95 ± 7 % po 24 hodinách. Z 34 testovaných indolů způsobily 5-jodindol a 4-fluorindol v koncentraci 1 mM 100% mortalitu, zatímco 5,6-difluorindigo, methylindol-7-karboxylát a 7-jodindol způsobily přibližně 50% mortalitu (tabulka 1).
Vliv 5-jodindolu na tvorbu vakuol a metabolismus háďátka borovicového. (A) Účinek avermektinu a 5-jodindolu na dospělé samčí háďátka, (B) vajíčka háďátek ve stádiu L1 a (C) metabolismus B. xylophilus, (i) vakuoly nebyly pozorovány v 0 h, léčba vedla k (ii) vakuolám, (iii) akumulaci mnohočetných vakuol, (iv) otokům vakuol a vakuolám (vi) tvorba obřích vakuol. Červené šipky označují otok vakuol, modré šipky označují splynutí vakuol a černé šipky označují obří vakuoly. Měřítko = 50 μm.
Kromě toho tato studie také popsala sekvenční proces metanem indukované smrti u háďátek borovicových (obrázek 4C). Methanogenní smrt je neapoptotický typ buněčné smrti spojený s akumulací prominentních cytoplazmatických vakuol27. Zdá se, že morfologické defekty pozorované u háďátek borovicových úzce souvisejí s mechanismem smrti vyvolané metanem. Mikroskopické vyšetření v různých časech ukázalo, že se po 20 hodinách expozice 5-jodindolu (0,1 mM) vytvořily obří vakuoly. Mikroskopické vakuoly byly pozorovány po 8 hodinách léčby a jejich počet se zvýšil po 12 hodinách. Po 14 hodinách bylo pozorováno několik velkých vakuol. Několik fúzovaných vakuol bylo jasně viditelných po 12–16 hodinách léčby, což naznačuje, že fúze vakuol je základem mechanismu methanogenní smrti. Po 20 hodinách bylo v červu nalezeno několik obřích vakuol. Tato pozorování představují první zprávu o metuóze u C. elegans.
U červů ošetřených 5-jodindolem byla také pozorována agregace a prasknutí vakuoly (obr. 5), jak dokládá ohyb červa a uvolnění vakuoly do prostředí. Narušení vakuoly bylo také pozorováno v membráně vaječné skořápky, která je normálně zachována neporušená L2 během líhnutí (doplňkový obr. S2). Tato pozorování podporují zapojení akumulace tekutin a osmoregulačního selhání, stejně jako reverzibilní poškození buněk (RCI), v procesu tvorby a hnisání vakuol (obr. 5).
S hypotézou o roli jódu v pozorované tvorbě vakuol jsme zkoumali nematocidní aktivitu jodidu sodného (NaI) a jodidu draselného (KI). Při koncentracích (0,1, 0,5 nebo 1 mM) však neovlivnily ani přežití nematodů, ani tvorbu vakuol (doplňkový obrázek S5), ačkoli 1 mM KI měl mírný nematocidní účinek. Na druhé straně 7-jodoindol (1 nebo 2 mM), stejně jako 5-jodoindol, vyvolal mnohočetné vakuoly a strukturální deformace (doplňkový obrázek S6). Tyto dva jodoindoly vykazovaly podobné fenotypové charakteristiky u háďátek borovicových, zatímco NaI a KI nikoli. Je zajímavé, že indol neindukoval tvorbu vakuol v B. xylophilus v testovaných koncentracích (data nejsou uvedena). Výsledky tedy potvrdily, že komplex indol-jód je zodpovědný za vakuolizaci a metabolismus B. xylophilus.
Mezi indoly testovanými na nematocidní aktivitu měl 5-jodindol nejvyšší index skluzu -5,89 kcal/mol, následovaný 7-jodindolem (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindolem (-4,33) a indolem (-4,03) (obrázek 6). Silná hlavní vodíková vazba 5-jodindolu na leucin 218 stabilizuje jeho vazbu, zatímco všechny ostatní indolové deriváty se vážou na serin 260 prostřednictvím vodíkových vazeb postranních řetězců. Mezi dalšími modelovanými jodoindoly má 2-jodindol vazebnou hodnotu -5,248 kcal/mol, což je způsobeno jeho hlavní vodíkovou vazbou s leucinem 218. Mezi další známé vazby patří 3-jodindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodindol (-4,0 kcal/mol)Sucal ppm fluoroindole Obrázek 6-2lementarymol.mol. S8). Většina halogenovaných indolů a samotný indol, s výjimkou 5-jodindolu a 2-jodindolu, tvoří vazbu se serinem 260. Skutečnost, že vodíková vazba s leucinem 218 svědčí o účinné vazbě receptor-ligand, jak bylo pozorováno u ivermektinu (doplňkový obr. S7), potvrzuje, že se váže idovermolecio a 5-tindolecio2 těsně k aktivnímu místu GluCL receptoru prostřednictvím leucinu 218 (obr. 6 a doplňkový obr. S8). Navrhujeme, že tato vazba je nutná k udržení otevřené struktury pórů komplexu GluCL a že díky těsné vazbě na aktivní místo receptoru GluCL, 5-jodindol, 2-jodindol, avermektin a ivermektin tak udrží iontový kanál otevřený a umožní příjem tekutin.
Molekulární dokování indolu a halogenovaného indolu na GluCL. Vazebné orientace ligandů (A) indolu, (B) 4-fluorindolu, (C) 7-jodindolu a (D) 5-jodindolu k aktivnímu místu GluCL. Protein je znázorněn stuhou a vodíkové vazby páteře jsou znázorněny jako žluté tečkované čáry. (A′), (B′), (C′) a (D′) ukazují interakce odpovídajících ligandů s okolními aminokyselinovými zbytky a vodíkové vazby postranního řetězce jsou označeny růžovými tečkovanými šipkami.
Byly provedeny experimenty pro hodnocení toxického účinku 5-jodindolu na klíčení semen zelí a ředkviček. 5-Jodindol (0,05 nebo 0,1 mM) nebo avermektin (10 μg/ml) měly malý nebo žádný účinek na počáteční klíčení a vzejití rostlinek (obrázek 7). Kromě toho nebyl nalezen žádný významný rozdíl mezi rychlostí klíčení neošetřených kontrol a semen ošetřených 5-jodindolem nebo avermektinem. Vliv na prodloužení kůlových kořenů a počet vytvořených postranních kořenů byl nevýznamný, ačkoli 1 mM (10násobek aktivní koncentrace) 5-jodindolu mírně zpomalil vývoj postranních kořenů. Tyto výsledky ukazují, že 5-jodindol je netoxický pro rostlinné buňky a neinterferuje s procesy vývoje rostlin ve studovaných koncentracích.
Vliv 5-jodindolu na klíčení semen. Klíčení, klíčení a boční zakořenění semen B. oleracea a R. raphanistrum na agarovém médiu Murashige a Skoog s nebo bez avermektinu nebo 5-jodoindolu. Klíčení bylo zaznamenáno po 3 dnech inkubace při 22 °C.
Tato studie uvádí několik případů zabíjení háďátek indoly. Důležité je, že toto je první zpráva o methylaci indukující jodoindol (proces způsobený akumulací malých vakuol, které se postupně spojují do obřích vakuol, což nakonec vede k prasknutí membrány a smrti) v jehličí borovice, přičemž jodoindol vykazuje významné nematocidní vlastnosti podobné vlastnostem komerčního nematicidu avermektinu.
Již dříve bylo popsáno, že indoly u prokaryot a eukaryot uplatňují více signálních funkcí, včetně inhibice/tvorby biofilmu, přežití bakterií a patogenity19,32,33,34. V poslední době přitahují potenciální terapeutické účinky halogenovaných indolů, indolových alkaloidů a semisyntetických derivátů indolu rozsáhlý výzkumný zájem35,36,37. Například bylo prokázáno, že halogenované indoly zabíjejí perzistentní buňky Escherichia coli a Staphylococcus aureus37. Kromě toho je ve vědeckém zájmu studovat účinnost halogenovaných indolů proti jiným druhům, rodům a říším a tato studie je krokem k dosažení tohoto cíle.
Zde navrhujeme mechanismus pro 5-jodindolem indukovanou letalitu u C. elegans založený na reverzibilním poškození buněk (RCI) a methylaci (obrázky 4C a 5). Edematózní změny jako otoky a vakuolární degenerace jsou indikátory RCI a metylace, které se projevují jako obří vakuoly v cytoplazmě48,49. RCI narušuje produkci energie tím, že snižuje produkci ATP, způsobuje selhání pumpy ATPázy nebo narušuje buněčné membrány a způsobuje rychlý příliv Na+, Ca2+ a vody50,51,52. Intracytoplazmatické vakuoly vznikají v živočišných buňkách jako výsledek akumulace tekutiny v cytoplazmě v důsledku přílivu Ca2+ a vody53. Je zajímavé, že tento mechanismus poškození buněk je reverzibilní, pokud je poškození dočasné a buňky začnou po určitou dobu produkovat ATP, ale pokud poškození přetrvává nebo se zhorší, buňky odumírají.54 Naše pozorování ukazují, že háďátka ošetřená 5-jodoindolem nejsou schopna obnovit normální biosyntézu po vystavení stresovým podmínkám.
Fenotyp methylace indukovaný 5-jodoindolem v B. xylophilus může být způsoben přítomností jódu a jeho molekulární distribucí, protože 7-jodindol měl menší inhibiční účinek na B. xylophilus než 5-jodoindol (tabulka 1 a doplňkový obrázek S6). Tyto výsledky jsou částečně v souladu se studiemi Maltese et al. (2014), kteří uvedli, že translokace pyridylového dusíkového zbytku v indolu z para- do meta-polohy zrušila vakuolizaci, inhibici růstu a cytotoxicitu v buňkách U251, což naznačuje, že interakce molekuly se specifickým aktivním místem v proteinu je kritická27,44,45. Interakce mezi indolovými nebo halogenovanými indoly a receptory GluCL pozorované v této studii také podporují tuto představu, protože bylo zjištěno, že 5- a 2-jodindol se vážou na receptory GluCL silněji než ostatní zkoumané indoly (obrázek 6 a doplňkový obrázek S8). Bylo zjištěno, že jód na druhé nebo páté pozici indolu se váže na leucin 218 receptoru GluCL prostřednictvím vodíkových vazeb hlavního řetězce, zatímco jiné halogenované indoly a samotný indol tvoří slabé vodíkové vazby postranního řetězce se serinem 260 (obrázek 6). Proto spekulujeme, že lokalizace halogenu hraje důležitou roli při indukci vakuolární degenerace, zatímco těsná vazba 5-jodindolu udržuje iontový kanál otevřený, čímž umožňuje rychlý přítok tekutiny a prasknutí vakuoly. Zbývá však určit podrobný mechanismus účinku 5-jodindolu.
Před praktickou aplikací 5-jodindolu by měl být analyzován jeho toxický účinek na rostliny. Naše experimenty s klíčením semen ukázaly, že 5-jodindol neměl při studovaných koncentracích žádný negativní vliv na klíčení semen nebo následné procesy vývoje (obrázek 7). Tato studie tedy poskytuje základ pro použití 5-jodoindolu v ekologickém prostředí ke kontrole škodlivosti háďátek borovicových na borovice.
Předchozí zprávy ukázaly, že terapie na bázi indolu představuje potenciální přístup k řešení problému rezistence na antibiotika a progrese rakoviny55. Kromě toho mají indoly antibakteriální, protirakovinné, antioxidační, protizánětlivé, antidiabetické, antivirové, antiproliferativní a antituberkulotické účinky a mohou sloužit jako slibný základ pro vývoj léčiv56,57. Tato studie poprvé naznačuje potenciální použití jódu jako antiparazitického a anthelmintického činidla.
Avermektin byl objeven před třemi desetiletími a v roce 2015 získal Nobelovu cenu a jeho použití jako anthelmintika stále aktivně probíhá. Vzhledem k rychlému rozvoji rezistence vůči avermektinům u háďátek a hmyzích škůdců je však pro kontrolu infekce háďátkem borovic potřeba alternativní, nízkonákladová a ekologická strategie. Tato studie také uvádí mechanismus, kterým 5-jodoindol zabíjí háďátka borovicová a že 5-jodoindol má nízkou toxicitu pro rostlinné buňky, což otevírá dobré vyhlídky pro jeho budoucí komerční využití.
Všechny experimenty byly schváleny etickou komisí Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, a metody byly provedeny v souladu s pokyny Etické komise Yeungnam University.
Experimenty s inkubací vajíček byly prováděny za použití zavedených postupů43. Pro posouzení míry líhnutí (HR) se jednodenní dospělí háďátka (přibližně 100 samic a 100 samců) přenesli do Petriho misek obsahujících houbu a nechali se růst po dobu 24 hodin. Vejce pak byla izolována a ošetřena 5-jodindolem (0,05 mM a 0,1 mM) nebo avermektinem (10 ug/ml) jako suspenze ve sterilní destilované vodě. Tyto suspenze (500 μl; přibližně 100 vajíček) byly přeneseny do jamek 24jamkové destičky pro tkáňové kultury a inkubovány při 22 °C. Počty L2 byly provedeny po 24 hodinách inkubace, ale byly považovány za mrtvé, pokud se buňky nepohybovaly při stimulaci jemným platinovým drátem. Tento experiment byl proveden ve dvou fázích, každá se šesti opakováními. Data z obou experimentů byla spojena a prezentována. Procento HR se vypočítá takto:
Larvální mortalita byla hodnocena pomocí dříve vyvinutých postupů. Vajíčka hlístic byla odebrána a embrya byla synchronizována vylíhnutím ve sterilní destilované vodě, aby se vytvořily larvy ve stádiu L2. Synchronizované larvy (přibližně 500 hlístic) byly ošetřeny 5-jodindolem (0,05 mM a 0,1 mM) nebo avermektinem (10 μg/ml) a chovány na Petriho miskách B. cinerea. Po 48 hodinách inkubace při 22 °C byla háďátka shromážděna ve sterilní destilované vodě a vyšetřena na přítomnost stádií L2, L3 a L4. Přítomnost stádií L3 a L4 indikovala larvální transformaci, zatímco přítomnost stádia L2 nenaznačovala žádnou transformaci. Snímky byly pořízeny pomocí systému digitálního zobrazování buněk iRiS™. Tento experiment byl proveden ve dvou fázích, každá se šesti opakováními. Data z obou experimentů byla spojena a prezentována.
Toxicita 5-jodindolu a avermektinu pro semena byla hodnocena pomocí testů klíčení na agarových plotnách Murashige a Skoog.62 Semena B. oleracea a R. raphanistrum byla nejprve namočena ve sterilní destilované vodě na jeden den, promyta 1 ml 100% etanolu, sterilizována 1 ml pěti 150% ethanolem promytým 50% roztokem chloridu sodného a promytým 50% roztokem chloridu sodného krát s 1 ml sterilní vody. Sterilizovaná semena pak byla nalisována na misky na klíčící agar obsahující 0,86 g/l (0,2X) Murashigeho a Skoogova média a 0,7 % bakteriologického agaru s nebo bez 5-jodindolu nebo avermektinu. Destičky byly poté inkubovány při 22 °C a snímky byly pořízeny po 3 dnech inkubace. Tento experiment byl proveden ve dvou fázích, z nichž každá měla šest opakování.
Čas odeslání: 26. února 2025