Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepších výsledků doporučujeme používat novější verzi prohlížeče (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím, abychom zajistili průběžnou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Objev a prospěšné využití přírodních produktů může pomoci zlepšit lidský život. Chemikálie inhibující růst rostlin se široce používají jako herbicidy k hubení plevelů. Vzhledem k nutnosti používat různé typy herbicidů je třeba identifikovat sloučeniny s novými mechanismy účinku. V této studii jsme objevili novou N-alkoxypyrrolovou sloučeninu, kumamonamid, ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 a stanovili kompletní proces syntézy. Prostřednictvím testů biologické aktivity jsme zjistili, že kyselina urs-monoamová je syntetickým meziproduktem urs-monoamidu a potenciálním...inhibitor růstu rostlinKromě toho jsme vyvinuli různé deriváty kyseliny urbenonové, včetně derivátu urbenonové kyseliny (UDA), který má vysokou herbicidní aktivitu, aniž by negativně ovlivňoval růst buněk HeLa. Zjistili jsme také, že deriváty kyseliny urmotonové narušují rostlinné mikrotubuly; KAND navíc ovlivňuje aktinové filamenty a indukuje buněčnou smrt; tyto mnohostranné účinky se liší od účinků známých inhibitorů mikrotubulů a naznačují nový mechanismus účinku kyseliny ursonové, což představuje důležitou výhodu při vývoji nových herbicidů.
Objev a praktické využití prospěšných přírodních produktů a jejich derivátů je prostředkem ke zlepšení kvality lidského života. Sekundární metabolity produkované mikroorganismy, rostlinami a hmyzem vedly k velkému pokroku v medicíně a zemědělství. Z přírodních produktů bylo vyvinuto mnoho antibiotik a léků proti leukémii. Kromě toho různé druhy...pesticidyZ těchto přírodních produktů se extrahují fungicidy a herbicidy pro použití v zemědělství. Zejména herbicidy proti plevelu jsou důležitými nástroji pro zvyšování výnosů plodin v moderním zemědělství a různé typy sloučenin se již komerčně používají. Několik buněčných procesů v rostlinách, jako je fotosyntéza, metabolismus aminokyselin, syntéza buněčné stěny, regulace mitózy, signalizace fytohormonů nebo syntéza proteinů, je považováno za typické cíle herbicidů. Sloučeniny, které inhibují funkci mikrotubulů, jsou běžnou třídou herbicidů, které ovlivňují růst rostlin ovlivněním mitotické regulace2.
Mikrotubuly jsou součástí cytoskeletu a jsou v eukaryotických buňkách široce konzervované. Heterodimer tubulinu se skládá z α-tubulinu a β-tubulinu, které tvoří lineární protofilamenty mikrotubulů, přičemž 13 protofilament tvoří válcovou strukturu. Mikrotubuly hrají v rostlinných buňkách mnoho rolí, včetně určování tvaru buněk, buněčného dělení a intracelulárního transportu3,4. Rostlinné buňky obsahují mikrotubuly pod interfázovou plazmatickou membránou a předpokládá se, že tyto tzv. kortikální mikrotubuly řídí organizaci celulózových mikrofibril regulací komplexů celulózové syntázy4,5. Kortikální mikrotubuly kořenových epidermálních buněk, přítomné v zóně rychlého prodlužování kořenové špičky, jsou umístěny laterálně a celulózová mikrovlákna tyto mikrotubuly sledují a omezují směr expanze buněk, čímž podporují anizotropní prodlužování buněk. Funkce mikrotubulů je proto úzce spjata s morfologií rostliny. Substituce aminokyselin v genech kódujících tubulin způsobují u Arabidopsis vychýlení kortikálních polí mikrotubulů a růst vlevo nebo vpravo6,7. Podobně mutace v proteinech asociovaných s mikrotubuly, které regulují dynamiku mikrotubulů, mohou také vést k narušenému růstu kořenů8,9,10,11,12,13. Kromě toho ošetření herbicidy narušujícími mikrotubuly, jako je disopyramid, známý také jako pretilachlor, také způsobuje levostranný šikmý růst kořenů14. Tato data naznačují, že přesná regulace funkce mikrotubulů je zásadní pro určení směru růstu rostlin.
Byly objeveny různé typy inhibitorů mikrotubulů a tyto léky významně přispěly k výzkumu cytoskeletu, stejně jako k zemědělství a medicíně2. Zejména oryzalin, dinitroanilinové sloučeniny, disopyramid, sloučeniny příbuzné benzamidu a jejich analogy mohou inhibovat funkci mikrotubulů a tím inhibovat růst rostlin. Proto se široce používají jako herbicidy. Vzhledem k tomu, že mikrotubuly jsou důležitou součástí rostlinných a živočišných buněk, je většina inhibitorů mikrotubulů cytotoxická pro oba typy buněk. Proto se i přes jejich uznávanou použitelnost jako herbicidů v praxi používá jen omezený počet látek s antimikrotubulárním účinkem.
Streptomyces je rod z čeledi Streptomyces, která zahrnuje aerobní, grampozitivní, vláknité bakterie a je všeobecně známý svou schopností produkovat širokou škálu sekundárních metabolitů. Proto je považován za jeden z nejdůležitějších zdrojů nových biologicky aktivních přírodních produktů. V této studii jsme objevili novou sloučeninu zvanou kumamonamid, která byla izolována ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486. Pomocí spektrální analýzy a plné spektrální analýzy byla charakterizována struktura kumamonamidu a stanoven jeho unikátní N-alkoxypyrrolový skelet. Bylo zjištěno, že kyselina ursmonová, syntetický meziprodukt ursmonoamidu a jeho derivátů, inhibuje růst a klíčení populární modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Ve studii vztahu struktury a aktivity jsme zjistili, že sloučenina s C9 modifikovanou na kyselinu ursonovou, nazývaná nonyloxyderivát kyseliny ursonové (KAND), významně zvyšuje inhibiční účinek na růst a klíčení. Je pozoruhodné, že nově objevený inhibitor růstu rostlin ovlivnil také růst tabáku a játrovky a nebyl cytotoxický pro bakterie ani buňky HeLa. Některé deriváty kyseliny urmotonové navíc indukují deformovaný fenotyp kořenů, což naznačuje, že tyto deriváty přímo či nepřímo ovlivňují mikrotubuly. V souladu s touto myšlenkou naše pozorování mikrotubulů značených buď imunohistochemicky, nebo fluorescenčními proteiny naznačují, že ošetření KAND depolymerizuje mikrotubuly. Kromě toho ošetření deriváty kyseliny kumamotonové narušilo aktinové mikrofilamenty. Objevili jsme tedy nový inhibitor růstu rostlin, jehož jedinečný mechanismus účinku zahrnuje destrukci cytoskeletu.
Kmen MK493-CF1 byl izolován z půdy v Shinagawa-ku v Tokiu. Kmen MK493-CF1 tvořil dobře rozvětvené stromální mycelium. Byla stanovena parciální sekvence genu 16S ribozomální RNA (1422 bp). Tento kmen je velmi podobný S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typický kmen, 99,93 %). Na základě tohoto výsledku bylo zjištěno, že tento kmen je blízce příbuzný typovému kmeni S. werraensis. Proto jsme tento kmen prozatímně pojmenovali S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T také produkuje stejné bioaktivní sloučeniny. Vzhledem k tomu, že v rané fázi bylo jen málo výzkumů zaměřených na získávání přírodních produktů z tohoto mikroorganismu, byl proveden další chemický výzkum. Po kultivaci S. werraensis MK493-CF1 na ječném médiu fermentací v pevné fázi při 30 °C po dobu 14 dnů bylo médium extrahováno 50% EtOH. 60 ml vzorku bylo vysušeno za účelem získání 59,5 mg surového extraktu. Surový extrakt byl podroben HPLC s reverzní fází za účelem získání N-methoxy-1H-pyrrol-2-karboxamidu (1, nazývaného kumamonamid, 36,0 mg). Celkové množství sloučeniny 1 představuje přibližně 60 % surového extraktu. Proto jsme se rozhodli podrobně prostudovat vlastnosti kumamoamidu 1.
Kumamonamid 1 je bílý amorfní prášek a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRESIMS) potvrzuje přítomnost C6H8N2O2 (obr. 1). C2-substituovaný pyrrolový fragment této sloučeniny je charakterizován hodnotami δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH v 1H NMR spektru: 4,5 Hz, H-5) a δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) a 13C NMR spektrum ukazuje přítomnost čtyř atomů uhlíku sp2. Přítomnost amidové skupiny v poloze C2 byla stanovena pomocí HMBC korelace od protonu C-3 k amidovému karbonylovému uhlíku při δC 161,1. Kromě toho píky 1H a 13C NMR při δH 4,10 (3H, S) a δC 68,3 naznačují přítomnost N-methoxy skupin v molekule. Ačkoli správná poloha methoxyskupiny dosud nebyla stanovena pomocí spektroskopické analýzy, jako je zesílená diferenční spektroskopie a zkratka nukleárního Overhausera (NOEDF), první kandidátskou sloučeninou se stal N-methoxy-1H-pyrrol-2-karboxamid.
Pro stanovení správné struktury sloučeniny 1 byla provedena totální syntéza (obr. 2a). Zpracování komerčně dostupného 2-aminopyridinu 2 s m-CPBA vedlo k odpovídajícímu N-oxidu 3 v kvantitativním výtěžku. Po 2-aminoazidaci sloučeniny 2 byla provedena cyklokondenzační reakce popsaná Abramovičem v benzenu při 90 °C za účelem získání požadovaného 1-hydroxy-1H-pyrrol-2-karbonitrilu 5 v gramech. Rychlost 60 % (dva stupně). 15,16. Methylace a hydrolýza sloučeniny 4 poté poskytly 1-methoxy-1H-pyrrol-2-karboxylovou kyselinu (označovanou jako „kumotonová kyselina“, 6) v dobrém výtěžku (70 %, dva kroky). Nakonec amidace přes meziprodukt chloridu kyseliny 6 za použití vodného amoniaku poskytla Kumamotův amid 1 v 98% výtěžku. Všechna spektrální data syntetizované sloučeniny 1 byla podobná izolované sloučenině 1, takže byla stanovena struktura sloučeniny 1;
Obecná syntéza a analýza biologické aktivity urbenamidu a kyseliny urbenové. (a) Celková syntéza Kumamotového amidu. (b) Sedmidenní sazenice divokého typu Arabidopsis Columbia (Col) byly pěstovány na plotnách Murashige a Skoog (MS) obsahujících kumamonamid 6 nebo kumamonamid 1 v uvedených koncentracích. Měřítko = 1 cm.
Nejprve jsme posoudili biologické aktivity urbenamidu a jeho meziproduktů z hlediska jejich schopnosti modulovat růst rostlin. Do MS agarového média jsme přidali různé koncentrace ursmonamidu 1 nebo kyseliny ursmonové 6 a na tomto médiu jsme kultivovali sazenice Arabidopsis thaliana. Tyto testy ukázaly, že vysoké koncentrace (500 μM) sloučeniny 6 inhibovaly růst kořenů (obr. 2b). Dále jsme vytvořili různé deriváty substitucí sloučeniny 6 v poloze N1 a provedli na nich studie vztahu struktura-aktivita (proces syntézy analogů je popsán v doplňujících informacích (SI)). Sazenice Arabidopsis byly pěstovány na médiu obsahujícím 50 μM derivátů kyseliny ursonové a byla měřena délka kořenů, jak je znázorněno na obrázku. Jak je znázorněno na obrázcích 3a, b a S1, kyseliny kumamo mají různé délky lineárních alkoxy řetězců (9, 10, 11, 12 a 13) nebo velkých alkoxy řetězců (15, 16 a 17) v poloze N1. Deriváty vykazovaly významnou inhibici růstu kořenů. Kromě toho jsme zjistili, že aplikace 200 μM 10, 11 nebo 17 inhibovala klíčení (obr. 3c a S2).
Studie vztahu struktury a aktivity Kumamotového amidu a příbuzných sloučenin. (a) Struktura a schéma syntézy analogů. (b) Kvantifikace délky kořenů 7denních sazenic pěstovaných na MS médiu s nebo bez 50 μM derivátů kumamonamidu. Hvězdičky označují významné rozdíly oproti simulovanému ošetření (t-test, p< 0,05). n>18. Data jsou uvedena jako průměr ± SD. nt znamená „netestováno“, protože více než 50 % semen neklíčilo. (c) Kvantifikace klíčivosti ošetřených semen inkubovaných po dobu 7 dnů v MS médiu s nebo bez 200 μM kumamonamidu a příbuzných sloučenin. Hvězdičky označují významné rozdíly oproti simulovanému ošetření (chí-kvadrát test). n=96.
Je zajímavé, že přidání alkylových postranních řetězců delších než C9 snížilo inhibiční aktivitu, což naznačuje, že sloučeniny příbuzné kyselině kumamotové vyžadují postranní řetězce určité velikosti, aby projevily svou biologickou aktivitu.
Protože analýza vztahu struktury a aktivity ukázala, že C9 byl modifikován na kyselinu ursonovou a nonyloxyderivát kyseliny ursonové (dále jen KAND 11) byl nejúčinnějším inhibitorem růstu rostlin, provedli jsme podrobnější charakterizaci KAND 11. Ošetření Arabidopsis 50 μM KAND 11 téměř úplně zabránilo klíčení, zatímco nižší koncentrace (40, 30, 20 nebo 10 μM) KAND 11 inhibovaly růst kořenů v závislosti na dávce (obr. 4a, b). Abychom otestovali, zda KAND 11 ovlivňuje životaschopnost kořenového meristému, zkoumali jsme kořenové meristémy obarvené propidiumjodidem (PI) a měřili jsme velikost plochy meristému. Velikost meristému sazenic pěstovaných na médiu obsahujícím 25 μM KAND-11 byla 151,1 ± 32,5 μm, zatímco velikost meristému sazenic pěstovaných na kontrolním médiu obsahujícím DMSO byla 264,7 ± 30,8 μm (obr. 4c, d), což naznačuje, že KAND-11 obnovuje buněčnou aktivitu. šíření. Kořenový meristém. V souladu s tím ošetření KAND 11 snížilo množství signálu markeru buněčného dělení CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS v kořenovém meristému (obr. 4e) 17. Tyto výsledky naznačují, že KAND 11 inhibuje růst kořenů snížením aktivity buněčné proliferace.
Analýza inhibičního účinku derivátů kyseliny urbenonové (urbenyloxyderivátů) na růst. (a) 7 dní staré sazenice divokého typu Col pěstované na MS plotnách s uvedenými koncentracemi KAND 11. Měřítko = 1 cm. (b) Kvantifikace délky kořenů. Písmena označují významné rozdíly (Tukeyův HSD test, p< 0,05). n>16. Data jsou uvedena jako průměr ± SD. (c) Konfokální mikroskopie kořenů divokého typu Col barvených propidiumjodidem, pěstovaných na MS plotnách s nebo bez 25 μM KAND 11. Bílé závorky označují kořenový meristém. Měřítko = 100 µm. (d) Kvantifikace velikosti kořenového meristému (n = 10 až 11). Statistické rozdíly byly stanoveny pomocí t-testu (p< 0,05). Sloupce představují průměrnou velikost meristému. (e) Mikroskopie s diferenciálním interferenčním kontrastem (DIC) kořenového meristému obsahujícího konstrukt CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS barvené a barvené na 5denních sazenicích pěstovaných na MS plotnách s nebo bez 25 µM KAND testu.
Fytotoxicita KAND 11 byla dále testována s použitím další dvouděložné rostliny, tabáku (Nicotiana tabacum), a významného modelového organismu suchozemské rostliny, játrovky (Marchantia polymorpha). Stejně jako v případě Arabidopsis, sazenice tabáku SR-1 pěstované na médiu obsahujícím 25 μM KAND 11 vytvořily kratší kořeny (obr. 5a). Navíc 40 ze 48 semen vyklíčilo na miskách obsahujících 200 μM KAND 11, zatímco všech 48 semen vyklíčilo na simulovaně ošetřeném médiu, což naznačuje, že vyšší koncentrace KAND byly významné (p< 0,05; chí test - kvadratický) inhiboval klíčení tabáku. (Obr. 5b). Kromě toho byla koncentrace KAND 11, která inhibovala bakteriální růst v játrovce, podobná účinné koncentraci v Arabidopsis (Obr. 5c). Tyto výsledky naznačují, že KAND 11 může inhibovat růst řady rostlin. Poté jsme zkoumali možnou cytotoxicitu sloučenin souvisejících s monoamidem medvěda v jiných organismech, konkrétně v lidských buňkách HeLa a kmeni Escherichia coli DH5α, jako zástupcích vyšších živočišných a bakteriálních buněk. V sérii testů buněčné proliferace jsme pozorovali, že kumamonamid 1, kyselina kumamonamidová 6 a KAND 11 neovlivnily růst buněk HeLa ani E. coli v koncentracích 100 μM (Obr. 5d,e).
Inhibice růstu KAND 11 u organismů jiných než Arabidopsis. (a) Dvoutýdenní sazenice tabáku divokého typu SR-1 byly pěstovány na vertikálně umístěných MS miskách obsahujících 25 μM KAND 11. (b) Dvoutýdenní sazenice tabáku divokého typu SR-1 byly pěstovány na horizontálně umístěných MS miskách obsahujících 200 μM KAND 11. (c) Dvoutýdenní pupeny játrovky divokého typu Tak-1 pěstované na miskách Gamborg B5 s uvedenými koncentracemi KAND 11. Červené šipky označují spory, které přestaly růst během dvoutýdenní inkubační doby. (d) Test buněčné proliferace buněk HeLa. Počet životaschopných buněk byl měřen v pevných časových intervalech pomocí soupravy pro počítání buněk 8 (Dojindo). Jako kontrola byly buňky HeLa ošetřeny 5 μg/ml aktinomycinu D (Act D), který inhibuje transkripci RNA polymerázy a způsobuje buněčnou smrt. Analýzy byly provedeny v triplikátu. (e) Test buněčné proliferace E. coli. Růst E. coli byl analyzován měřením OD600. Jako kontrola byly buňky ošetřeny 50 μg/ml ampicilinu (Amp), který inhibuje syntézu bakteriální buněčné stěny. Analýzy byly provedeny v triplikátech.
Abychom rozluštili mechanismus účinku cytotoxicity způsobené sloučeninami příbuznými uramidu, znovu jsme analyzovali deriváty kyseliny urbenové se středními inhibičními účinky, jak je znázorněno na obrázku. Jak je znázorněno na obrázcích 2b a 6a, sazenice pěstované na agarových plotnách obsahujících vysoké koncentrace (200 μM) kyseliny urmotonové 6 produkovaly kratší a doleva zakřivené kořeny (θ = – 23,7 ± 6,1), zatímco sazenice pěstované na kontrolním médiu produkovaly téměř rovné kořeny (θ = – 3,8 ± 7,1). Je známo, že tento charakteristický šikmý růst je důsledkem dysfunkce kortikálních mikrotubulů14,18. V souladu s tímto zjištěním indukovaly léky destabilizující mikrotubuly disopyramid a oryzalin za našich růstových podmínek podobné naklonění kořenů (obr. 2b a 6a). Zároveň jsme testovali deriváty kyseliny urmotonové a vybrali několik z nich, které při určitých koncentracích indukovaly šikmý růst kořenů. Sloučeniny 8, 9 a 15 změnily směr růstu kořenů při 75 μM, 50 μM a 40 μM, což naznačuje, že tyto sloučeniny mohou účinně destabilizovat mikrotubuly (obr. 2b, 6a). Testovali jsme také nejúčinnější derivát kyseliny ursolové, KAND 11, při nižší koncentraci (15 µM) a zjistili jsme, že aplikace KAND 11 inhibovala růst kořenů a že směr růstu kořenů byl nerovnoměrný, i když měly tendenci se svažovat doleva (obrázek C3). Protože vyšší koncentrace léčiv destabilizujících mikrotubuly někdy spíše inhibují růst rostlin, než aby způsobovaly naklánění kořenů, následně jsme posoudili možnost, že KAND 11 ovlivňuje mikrotubuly, pozorováním kortikálních mikrotubulů v epidermálních buňkách kořenů. Imunohistochemie s použitím protilátek proti β-tubulinu v epidermálních buňkách kořenů sazenic ošetřených 25 μM KAND 11 ukázala zmizení téměř všech kortikálních mikrotubulů v epidermálních buňkách v elongační zóně (obr. 6b). Tyto výsledky naznačují, že kyselina kumamotonová a její deriváty působí přímo nebo nepřímo na mikrotubuly a narušují je, a že tyto sloučeniny jsou novými inhibitory mikrotubulů.
Kyselina ursonová a její deriváty mění kortikální mikrotubuly u Arabidopsis thaliana. (a) Úhel sklonu kořene měřený v přítomnosti různých derivátů kyseliny urmotonové v uvedených koncentracích. Analyzovány byly také účinky dvou sloučenin, o nichž je známo, že inhibují mikrotubuly: disopyramidu a oryzalinu. Vložka ukazuje standard použitý k měření úhlu růstu kořene. Hvězdičky označují významné rozdíly oproti simulovanému ošetření (t-test, p< 0,05). n>19. Měřítko = 1 cm. (b) Kortikální mikrotubuly v epidermálních buňkách v elongační zóně. Mikrotubuly v kořenech divokého typu Arabidopsis Col pěstovaných na MS plotnách s nebo bez 25 μM KAND 11 byly vizualizovány imunohistochemickým barvením s použitím primárních protilátek proti β-tubulinu a sekundárních protilátek konjugovaných s Alexa Fluor. Měřítko = 10 µm. (c) Mitotická struktura mikrotubulů v kořenovém meristému. Mikrotubuly byly vizualizovány imunohistochemickým barvením. Mitotické struktury, včetně profázových zón, vřetének a fragmoplastů, byly spočítány z konfokálních snímků. Šipky označují mitotické struktury mikrotubulů. Hvězdičky označují významné rozdíly oproti simulovanému ošetření (t-test, p< 0,05). n>9. Měřítko = 50 µm.
Ačkoli má Ursa schopnost narušovat funkci mikrotubulů, očekává se, že její mechanismus účinku se bude lišit od typických činidel depolymerizujících mikrotubuly. Například vyšší koncentrace činidel depolymerizujících mikrotubuly, jako je disopyramid a oryzalin, indukují anizotropní expanzi epidermálních buněk, zatímco KAND 11 nikoli. Kromě toho společná aplikace KAND 11 a disopyramidu vedla ke kombinované disopyramidem indukované růstové reakci kořenů a byla pozorována inhibice růstu indukovaná KAND 11 (obr. S4). Analyzovali jsme také reakci hypersenzitivní mutanty disopyramid 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 má nekanonickou bodovou mutaci tubulinkinázy a při ošetření disopyramidem produkuje kratší kořeny9,20. Sazenice mutantu phs1-1 pěstované na agarovém médiu obsahujícím KAND 11 měly kratší kořeny podobné těm, které pěstovaly na disopyramidu (obr. S5).
Kromě toho jsme v kořenovém meristému sazenic ošetřených KAND 11 pozorovali mitotické mikrotubulární struktury, jako jsou profázové zóny, vřeténka a fragmoplasty. V souladu s pozorováními pro CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS byl pozorován významný pokles počtu mitotických mikrotubulů (obr. 6c).
Pro charakterizaci cytotoxicity KAND 11 v subcelulárním rozlišení jsme ošetřili suspenzní buňky tabáku BY-2 pomocí KAND 11 a pozorovali jejich reakci. Nejprve jsme přidali KAND 11 k buňkám BY-2 exprimujícím TagRFP-TUA6, který fluorescenčně značí mikrotubuly, abychom posoudili účinek KAND 11 na kortikální mikrotubuly. Hustota kortikálních mikrotubulů byla stanovena pomocí obrazové analýzy, která kvantifikovala procento cytoskeletálních pixelů mezi cytoplazmatickými pixely. Výsledky testu ukázaly, že po ošetření 50 μM nebo 100 μM KAND 11 po dobu 1 hodiny se hustota významně snížila na 0,94 ± 0,74 %, respektive 0,23 ± 0,28 %, zatímco hustota buněk ošetřených DMSO činila 1,61 ± 0,34 % (obr. 7a). Tyto výsledky jsou v souladu s pozorováním u Arabidopsis, že ošetření KAND 11 indukuje depolymerizaci kortikálních mikrotubulů (obr. 6b). Také jsme zkoumali linii BY-2 s aktinovými filamenty značenými GFP-ABD po ošetření stejnou koncentrací KAND 11 a pozorovali jsme, že ošetření KAND 11 narušilo aktinová filamenta. Ošetření 50 μM nebo 100 μM KAND 11 po dobu 1 hodiny významně snížilo hustotu aktinových filament na 1,20 ± 0,62 %, respektive 0,61 ± 0,26 %, zatímco hustota v buňkách ošetřených DMSO byla 1,69 ± 0,51 % (obr. 2). 7b). Tyto výsledky kontrastují s účinky propyzamidu, který aktinová filamenta neovlivňuje, a latrunkulinu B, depolymerizátoru aktinu, který neovlivňuje mikrotubuly (obrázek SI S6). Kromě toho ošetření kumamonamidem 1, kyselinou kumamonamidovou 6 nebo KAND 11 neovlivnilo mikrotubuly v buňkách HeLa (obrázek SI S7). Předpokládá se tedy, že mechanismus účinku KAND 11 se liší od mechanismu známých disruptorů cytoskeletu. Naše mikroskopické pozorování buněk BY-2 ošetřených KAND 11 navíc odhalilo nástup buněčné smrti během ošetření KAND 11 a ukázalo, že podíl mrtvých buněk obarvených Evansovou modří se po 30 minutách ošetření KAND 11 významně nezvýšil, zatímco po 90 minutách ošetření 50 μM nebo 100 μM KAND se počet mrtvých buněk zvýšil na 43,7 %, respektive 80,1 % (obr. 7c). Celkově vzato tato data naznačují, že nový derivát kyseliny ursolové KAND 11 je rostlinný specifický inhibitor cytoskeletu s dosud neznámým mechanismem účinku.
KAND ovlivňuje kortikální mikrotubuly, aktinové filamenty a životaschopnost tabákových buněk BY-2. (a) Vizualizace kortikálních mikrotubulů v buňkách BY-2 v přítomnosti TagRFP-TUA6. Buňky BY-2 ošetřené KAND 11 (50 μM nebo 100 μM) nebo DMSO byly zkoumány konfokální mikroskopií. Hustota kortikálních mikrotubulů byla vypočtena z mikrofotografií 25 nezávislých buněk. Písmena označují významné rozdíly (Tukeyův HSD test, p< 0,05). Měřítko = 10 µm. (b) Kortikální aktinové filamenty v buňkách BY-2 vizualizované v přítomnosti GFP-ABD2. Buňky BY-2 ošetřené KAND 11 (50 μM nebo 100 μM) nebo DMSO byly zkoumány konfokální mikroskopií. Hustota kortikálních aktinových filament byla vypočtena z mikrofotografií 25 nezávislých buněk. Písmena označují významné rozdíly (Tukeyův HSD test, p< 0,05). Měřítko = 10 µm. (c) Pozorování mrtvých buněk BY-2 barvením Evansovou modří. Buňky BY-2 ošetřené KAND 11 (50 μM nebo 100 μM) nebo DMSO byly zkoumány mikroskopií ve světlém poli. n=3. Měřítko = 100 µm.
Objev a aplikace nových přírodních produktů vedly k významnému pokroku v různých aspektech lidského života, včetně medicíny a zemědělství. Byl proveden historický výzkum s cílem získat užitečné sloučeniny z přírodních zdrojů. Zejména aktinomycety jsou známé jako užitečná antiparazitární antibiotika proti hlísticím díky své schopnosti produkovat různé sekundární metabolity, jako je avermektin, hlavní sloučenina ivermektinu, a bleomycin a jeho deriváty, používané v medicíně jako protinádorové činidlo21,22. Stejně tak byla z aktinomycetů objevena řada herbicidních sloučenin, z nichž některé se již používají komerčně1,23. Proto je analýza metabolitů aktinomycetů za účelem izolace přírodních produktů s požadovanými biologickými aktivitami považována za účinnou strategii. V této studii jsme objevili novou sloučeninu, kumamonamid, z S. werraensis a úspěšně ji syntetizovali. Kyselina ursonová je syntetický meziprodukt urbenamidu a jeho derivátů. Může způsobovat charakteristické kadeřání kořenů, vykazovat střední až silnou herbicidní aktivitu a přímo či nepřímo poškozovat rostlinné mikrotubuly. Mechanismus účinku kyseliny urmotonové se však může lišit od mechanismu stávajících inhibitorů mikrotubulů, protože KAND 11 také narušuje aktinová filamenta a způsobuje buněčnou smrt, což naznačuje regulační mechanismus, kterým kyselina urmotonová a její deriváty ovlivňují širokou škálu cytoskeletálních struktur.
Další detailní charakterizace kyseliny urbenonové pomůže lépe pochopit mechanismus jejího účinku. Dalším cílem je zejména vyhodnotit schopnost kyseliny ursonové vázat se na redukované mikrotubuly, aby se zjistilo, zda kyselina ursonová a její deriváty působí přímo na mikrotubuly a depolymerují je, nebo zda jejich působení vede k destabilizaci mikrotubulů. Kromě toho v případě, kdy mikrotubuly nejsou přímým cílem, identifikace místa účinku a molekulárních cílů kyseliny ursonové na rostlinných buňkách pomůže lépe pochopit vlastnosti příbuzných sloučenin a možné způsoby, jak zlepšit herbicidní aktivitu. Náš test bioaktivity odhalil jedinečnou cytotoxickou schopnost kyseliny ursonové na růst rostlin, jako je Arabidopsis thaliana, tabák a játrovka, zatímco buňky E. coli ani HeLa nebyly ovlivněny. Malá nebo žádná toxicita pro živočišné buňky je výhodou derivátů kyseliny ursonové, pokud jsou vyvinuty jako herbicidy pro použití na otevřených zemědělských polích. Vzhledem k tomu, že mikrotubuly jsou běžnými strukturami u eukaryot, je jejich selektivní inhibice v rostlinách klíčovým požadavkem na herbicidy. Například propyzamid, činidlo depolymerizující mikrotubuly, které se přímo váže na tubulin a inhibuje polymeraci, se používá jako herbicid kvůli své nízké toxicitě pro živočišné buňky24. Na rozdíl od disopyramidu mají příbuzné benzamidy odlišnou cílovou specificitu. Kromě rostlinných mikrotubulů inhibuje RH-4032 neboli benzoxamid také mikrotubuly živočišných buněk, respektive oomycetů, a zalilamid se používá jako fungicid kvůli své nízké fytotoxicitě25,26,27. Nově objevená medvědice a její deriváty vykazují selektivní cytotoxicitu proti rostlinám, ale stojí za zmínku, že další modifikace mohou změnit jejich cílovou specificitu, což by potenciálně mohlo poskytnout další deriváty pro kontrolu patogenních hub nebo oomycetů.
Jedinečné vlastnosti kyseliny urbenonové a jejích derivátů jsou užitečné pro jejich vývoj jako herbicidů a pro jejich využití jako výzkumných nástrojů. Význam cytoskeletu při řízení tvaru rostlinných buněk je všeobecně uznáván. Dřívější studie ukázaly, že rostliny si vyvinuly komplexní mechanismy organizace kortikálních mikrotubulů řízením dynamiky mikrotubulů pro správnou kontrolu morfogeneze. Bylo identifikováno velké množství molekul zodpovědných za regulaci aktivity mikrotubulů a související výzkum stále probíhá3,4,28. Naše současné chápání dynamiky mikrotubulů v rostlinných buňkách plně nevysvětluje mechanismy organizace kortikálních mikrotubulů. Například, ačkoli disopyramid i oryzalin mohou depolymerizovat mikrotubuly, disopyramid způsobuje vážné deformace kořenů, zatímco oryzalin má relativně mírný účinek. Navíc mutace v tubulinu, který stabilizuje mikrotubuly, také způsobují dextrorotaci kořenů, zatímco paklitaxel, který také stabilizuje dynamiku mikrotubulů, nikoli. Studium a identifikace molekulárních cílů kyseliny ursolové by proto měly poskytnout nové poznatky o regulaci rostlinných kortikálních mikrotubulů. Stejně tak budoucí srovnání chemikálií, které účinně podporují narušený růst, jako je disopyramid, a méně účinných chemikálií, jako je oryzalin nebo kyselina kumamotorová, poskytne vodítko k tomu, jak k narušenému růstu dochází.
Na druhou stranu, obranné přeskupení cytoskeletu jsou další možností, jak vysvětlit cytotoxicitu kyseliny ursonové. Infekce patogenem nebo zavedení elicitoru do rostlinných buněk někdy způsobuje destrukci cytoskeletu a následnou buněčnou smrt29. Například bylo popsáno, že kryptoxanthin odvozený z oomycet narušuje mikrotubuly a aktinové filamenty před smrtí tabákových buněk, podobně jako při léčbě KAND30,31. Podobnosti mezi obrannými reakcemi a buněčnými reakcemi indukovanými kyselinou ursonovou nás vedly k hypotéze, že spouštějí běžné buněčné procesy, ačkoli je zřejmý rychlejší a silnější účinek kyseliny ursonové než kryptoxanthinu. Studie však ukázaly, že narušení aktinových filament podporuje spontánní buněčnou smrt, která není vždy doprovázena narušením mikrotubulů29. Kromě toho zbývá zjistit, zda patogen nebo elicitor způsobuje narušený růst kořenů, jak to dělají deriváty kyseliny ursonové. Molekulární znalosti spojující obranné reakce a cytoskelet jsou tedy atraktivním problémem, který je třeba řešit. Využitím přítomnosti nízkomolekulárních sloučenin příbuzných kyselině ursonové, jakož i řady derivátů s různou účinností, mohou poskytnout příležitosti k cílení na neznámé buněčné mechanismy.
Objev a aplikace nových sloučenin, které modulují dynamiku mikrotubulů, dohromady poskytnou účinné metody pro řešení komplexních molekulárních mechanismů, které jsou základem určování tvaru rostlinných buněk. V této souvislosti může nedávno vyvinutá sloučenina kyselina urmotonová, která ovlivňuje mikrotubuly a aktinové filamenty a indukuje buněčnou smrt, poskytnout příležitost k rozluštění souvislosti mezi regulací mikrotubulů a těmito dalšími mechanismy. Chemická a biologická analýza s použitím kyseliny urbenonové nám tak pomůže pochopit molekulární regulační mechanismy, které řídí rostlinný cytoskelet.
Inokulujte S. werraensis MK493-CF1 do 500ml Erlenmeyerovy baňky s přepážkou obsahující 110 ml inokulačního média sestávajícího z 2 % (hm./obj.) galaktózy, 2 % (hm./obj.) pasty Essence, 1 % (hm./obj.) Bacto-sójového prostředku (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (hm./obj.) kukuřičného extraktu (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonsko), 0,2 % (hm./obj.) (NH4)2SO4 a 0,2 % CaCO3 v deionizované vodě (pH 7,4 před sterilizací). Inokulační kultury byly inkubovány na rotační třepačce (180 ot./min) při 27 °C po dobu 2 dnů. Produkční kultivace pomocí fermentace v pevné fázi. Iniciální kultura (7 ml) byla přenesena do 500ml baňky K-1 obsahující 40 g produkčního média sestávajícího z 15 g lisovaného ječmene (MUSO Co., Ltd., Japonsko) a 25 g deionizované vody (pH nebylo před sterilizací upraveno). Fermentace probíhala při 30 °C ve tmě po dobu 14 dnů. Fermentační materiál byl extrahován 40 ml/láhev EtOH a centrifugován (1500 g, 4 °C, 10 min). Supernatant kultury (60 ml) byl extrahován směsí 10% MeOH/EtOAc. Organická vrstva byla odpařena za sníženého tlaku, čímž byl získán zbytek (59,5 mg), který byl podroben HPLC s gradientovou elucí (0–10 minut: 90 %) na koloně s reverzní fází (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, vnitřní průměr 10 mm × délka 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90% H2O/CH3CN až 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90% H2O/EtOH, 45–155 minut: 90% H2O/EtOH až 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) při průtoku 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) byl izolován jako bílý amorfní prášek.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ vypočtená hodnota: 141,0659, naměřená hodnota: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semena rodu Columbia (Col-0) byla získána z Centra biologických zdrojů Arabidopsis (ABRC) s povolením k výzkumnému použití. Semena Col-0 byla rozmnožena a udržována v našich laboratorních podmínkách a použita jako rostliny Arabidopsis divokého typu. Semena Arabidopsis byla povrchově sterilizována a kultivována v poloviční koncentraci médiu Murashige a Skoog obsahujícím 2 % sacharózy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (hmotnost/objem) kyseliny 2-(4-morfolino)ethansulfonové (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) a 1,5 % agaru (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, při teplotě 23 °C a konstantním světle. Semena mutanta phs1-1 poskytl T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Semena kmene SR-1 poskytl T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) a byla použita jako rostliny tabáku divokého typu. Tabáková semena byla povrchově sterilizována a na tři noci namočena do sterilní vody pro podporu klíčení, poté umístěna do poloviční koncentrace roztoku obsahujícího 2 % sacharózy, 0,05 % (hmotnost/objem) MES a 0,8 % gellanové gumy (Fujifilm Wako Pure Chemical, Murashige a Skoogovo médium) s pH 5,7 a inkubována při 23 °C za stálého světla.
Kmen Tak-1 poskytl T. Kohchi (Kyoto University) a byl použit jako standardní experimentální jednotka pro studii jaterníků. Gemma byla získána ze sterilizovaných kultivovaných rostlin a poté nanesena na médium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) obsahující 1 % sacharózy a 0,3 % gellanové gumy a inkubována při 23 °C za nepřetržitého světla.
Tabákové buňky BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) poskytl S. Hasezawa (Univerzita v Tokiu). Buňky BY-2 byly 95krát zředěny v modifikovaném médiu Linsmeiera a Skooga a týdně doplňovány kyselinou 2,4-dichlorfenoxyoctovou 32. Buněčná suspenze byla míchána na rotační třepačce při 130 ot/min při 27 °C ve tmě. Buňky byly promyty 10násobným objemem čerstvého média a resuspendovány ve stejném médiu. Transgenní buněčné linie BY-2 stabilně exprimující mikrotubulární marker TagRFP-TUA6 nebo aktinový filamentní marker GFP-ABD2 pod promotorem 35S viru květákové mozaiky byly vytvořeny dle popsaného postupu 33, 34, 35. Tyto buněčné linie lze udržovat a synchronizovat pomocí postupů podobných těm, které byly použity pro původní buněčnou linii BY-2.
Buňky HeLa byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) (Life Technologies) doplněném 10 % fetálním bovinním sérem, 1,2 U/ml penicilinu a 1,2 μg/ml streptomycinu v inkubátoru při 37 °C s 5 % CO2.
Všechny experimenty popsané v tomto rukopisu byly provedeny v souladu s japonskými předpisy a pokyny pro biologickou bezpečnost.
Sloučeniny byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) jako zásobní roztoky a zředěny v MS médiu pro Arabidopsis a tabák nebo v médiu Gamborg B5 pro játrovku. Pro test inhibice růstu kořenů bylo na agarové médium obsahující uvedené sloučeniny nebo DMSO zaseto více než 10 semen na plotnu. Semena byla inkubována v pěstební komoře po dobu 7 dnů. Sazenice byly vyfotografovány a byla změřena délka kořenů. Pro test klíčení Arabidopsis bylo na agarové médium obsahující 200 μM sloučeniny nebo DMSO zaseto 48 semen na plotnu. Semena Arabidopsis byla pěstována v pěstební komoře a počet vyklíčených sazenic byl spočítán 7 dní po vyklíčení (dag). Pro test klíčení tabáku bylo na agarové médium obsahující 200 μM KAND nebo DMSO zaseto 24 semen na plotnu. Tabáková semena byla pěstována v pěstební komoře a počet vyklíčených sazenic byl spočítán po 14 dnech. Pro test inhibice růstu jaterníků bylo 9 embryí z každé plotny umístěno na agarové médium obsahující uvedené koncentrace KAND nebo DMSO a inkubováno v růstové komoře po dobu 14 dnů.
Pro vizualizaci organizace kořenového meristému použijte sazenice obarvené 5 mg/ml propidiumjodidem (PI). Signály PI byly pozorovány fluorescenční mikroskopií za použití konfokálního laserového skenovacího mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems).
Histochemické barvení kořenů β-glukuronidázou (GUS) bylo provedeno podle protokolu popsaného Malamim a Benfeyem36. Sazenice byly fixovány přes noc v 90% acetonu, obarveny 0,5 mg/ml kyseliny 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-glukuronové v GUS pufru po dobu 1 hodiny a umístěny do hydratovaného roztoku chloraldehydu (8 g chloralhydrátu, 2 ml vody a 1 ml glycerolu) a pozorovány diferenciální interferenční kontrastní mikroskopií za použití mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Kořenové úhly byly měřeny na 7denních sazenicích pěstovaných na svisle umístěných plotnách. Změřte úhel kořene od směru vektoru gravitace, jak je popsáno v kroku 6.
Uspořádání kortikálních mikrotubulů bylo pozorováno dle popsaného postupu s drobnými úpravami protokolu 37. Jako primární a sekundární protilátky byly použity protilátky proti β-tubulinu (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) a protilátky proti myšímu IgG konjugované s Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) v ředění 1:1000, respektive 1:100. Fluorescenční snímky byly pořízeny pomocí konfokálního laserového skenovacího mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems). Z-stack snímky byly pořízeny a projekce maximální intenzity byly vytvořeny podle pokynů výrobce.
Test proliferace buněk HeLa byl proveden za použití soupravy Cell Counting Kit 8 (Dojindo) podle pokynů výrobce.
Růst E. coli DH5α byl analyzován měřením buněčné hustoty v kultuře pomocí spektrofotometru při 600 nm (OD600).
Organizace cytoskeletu v transgenních buňkách BY-2 byla pozorována pomocí fluorescenčního mikroskopu vybaveného konfokálním skenovacím zařízením CSU-X1 (Yokogawa) a sCMOS kamerou (Zyla, Andor Technology). Hustota cytoskeletu byla hodnocena analýzou obrazu, která kvantifikovala procento cytoskeletálních pixelů mezi cytoplazmatickými pixely v konfokálních snímcích pomocí softwaru ImageJ, jak je popsáno38,39.
Pro detekci buněčné smrti v buňkách BY-2 byl alikvotní podíl buněčné suspenze inkubován s 0,05% Evansovou modří po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Selektivní barvení mrtvých buněk Evansovou modří závisí na vytlačování barviva z životaschopných buněk intaktní plazmatickou membránou40. Obarvené buňky byly pozorovány pomocí mikroskopu s jasným polem (BX53, Olympus).
Buňky HeLa byly pěstovány v DMEM doplněném 10% FBS ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C a 5% CO2. Buňky byly ošetřeny 100 μM KAND 11, kyselinou kumamonamovou 6, kumamonamidem 1, 100 ng/ml kolcemidu (Gibco) nebo 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) po dobu 6 hodin při 37 °C. Buňky byly fixovány MetOH po dobu 10 minut a poté acetátem po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Fixované buňky byly inkubovány s primární protilátkou proti β-tubulinu (1D4A4, Proteintech: 66240-1) zředěnou v 0,5% BSA/PBS po dobu 2 hodin, 3krát promyty TBST a poté inkubovány s kozí protilátkou Alexa Fluor. 488 po dobu 1 hodiny. – Myší IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) a 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) zředěného v 0,5% BSA/PBS. Po trojnásobném promytí TBST byly obarvené buňky pozorovány na invertovaném mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E. Snímky byly pořízeny chlazenou CCD kamerou Hamamatsu ORCA-R2 s použitím softwaru MetaMorph (Molecular Devices).
Čas zveřejnění: 17. června 2024