Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Pro dosažení nejlepších výsledků doporučujeme použít novější verzi prohlížeče (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme stránky bez stylů nebo JavaScriptu.
Objev a prospěšné využití přírodních produktů může pomoci zlepšit lidský život.Chemické látky inhibující růst rostlin jsou široce používány jako herbicidy pro kontrolu plevelů.Vzhledem k potřebě používat různé typy herbicidů je potřeba identifikovat sloučeniny s novými mechanismy účinku.V této studii jsme objevili novou N-alkoxypyrrolovou sloučeninu, kumamonamid, ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 a stanovili kompletní proces syntézy.Prostřednictvím testů biologické aktivity jsme zjistili, že kyselina urs-monoamová je syntetický meziprodukt urs-monoamidu a potenciálníinhibitor růstu rostlin.Kromě toho jsme vyvinuli různé deriváty kyseliny urbenonové, včetně urbenyloxyderivátu (UDA), který má vysokou herbicidní aktivitu, aniž by negativně ovlivnil růst buněk HeLa.Také jsme zjistili, že deriváty kyseliny urmotonové narušují rostlinné mikrotubuly;navíc KAND ovlivňuje aktinová vlákna a indukuje buněčnou smrt;Tyto mnohostranné účinky se liší od účinků známých inhibitorů mikrotubulů a naznačují nový mechanismus účinku kyseliny ursonové, což představuje důležitou výhodu ve vývoji nových herbicidů.
Objevování a praktické využití prospěšných přírodních produktů a jejich derivátů je prostředkem ke zlepšení kvality lidského života.Sekundární metabolity produkované mikroorganismy, rostlinami a hmyzem vedly k velkým pokrokům v medicíně a zemědělství.Mnoho antibiotik a léků proti leukémii bylo vyvinuto z přírodních produktů.Kromě toho různé druhypesticidyZ těchto přírodních produktů se pro použití v zemědělství extrahují fungicidy a herbicidy.Zejména herbicidy na hubení plevele jsou důležitými nástroji pro zvýšení výnosů plodin v moderním zemědělství a různé typy sloučenin se již komerčně používají.Některé buněčné procesy v rostlinách, jako je fotosyntéza, metabolismus aminokyselin, syntéza buněčné stěny, regulace mitózy, signalizace fytohormonů nebo syntéza proteinů, jsou považovány za typické cíle herbicidů.Sloučeniny, které inhibují funkci mikrotubulů, jsou běžnou třídou herbicidů, které ovlivňují růst rostlin ovlivněním mitotické regulace2.
Mikrotubuly jsou součástí cytoskeletu a jsou široce konzervované v eukaryotických buňkách.Tubulinový heterodimer se skládá z α-tubulinu a β-tubulinu tvořících lineární mikrotubulová protofilamenta, s 13 protofilamenty tvořícími válcovitou strukturu.Mikrotubuly hrají v rostlinných buňkách více rolí, včetně určování tvaru buňky, buněčného dělení a intracelulárního transportu3,4.Rostlinné buňky obsahují pod mezifázovou plazmatickou membránou mikrotubuly a předpokládá se, že tyto takzvané kortikální mikrotubuly řídí organizaci celulózových mikrofibril prostřednictvím regulace komplexů celulózové syntázy4,5.Kortikální mikrotubuly kořenových epidermálních buněk, přítomné v zóně rychlého prodlužování špičky kořene, jsou umístěny laterálně a celulózová mikrovlákna tyto mikrotubuly sledují a omezují směr buněčné expanze, čímž podporují anizotropní prodlužování buněk.Proto funkce mikrotubulů úzce souvisí s morfologií rostlin.Aminokyselinové substituce v genech kódujících tubulin způsobují zkreslení kortikálních mikrotubulů a levostranný nebo pravostranný růst u Arabidopsis 6,7.Podobně mutace v proteinech asociovaných s mikrotubuly, které regulují dynamiku mikrotubulů, mohou také vést k deformovanému růstu kořenů8,9,10,11,12,13.Navíc ošetření herbicidy narušujícími mikrotubuly, jako je disopyramid, také známý jako pretilachlor, také způsobuje levostranný šikmý růst kořenů14.Tato data naznačují, že přesná regulace funkce mikrotubulů je rozhodující pro určení směru růstu rostlin.
Byly objeveny různé typy inhibitorů mikrotubulů a tyto léky významně přispěly k výzkumu cytoskeletu, stejně jako k zemědělství a medicíně2.Zejména oryzalin, dinitroanilinové sloučeniny, disopyramid, sloučeniny příbuzné benzamidu a jejich analogy mohou inhibovat funkci mikrotubulů a tím inhibovat růst rostlin.Proto jsou široce používány jako herbicidy.Protože jsou však mikrotubuly důležitou složkou rostlinných a živočišných buněk, většina inhibitorů mikrotubulů je cytotoxická pro oba typy buněk.Proto, navzdory jejich uznávané užitečnosti jako herbicidů, se pro praktické účely používá omezený počet antimikrotubulových činidel.
Streptomyces je rod z čeledi Streptomyces, který zahrnuje aerobní, gram-pozitivní, vláknité bakterie a je široce známý pro svou schopnost produkovat širokou škálu sekundárních metabolitů.Proto je považován za jeden z nejdůležitějších zdrojů nových biologicky aktivních přírodních produktů.V současné studii jsme objevili novou sloučeninu zvanou kumamonamid, která byla izolována ze Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486. Pomocí spektrální analýzy a úplné spektrální analýzy byla charakterizována struktura kumamonamidu a jeho unikátní N-alkoxypyrrolový skelet byl odhodlaný.syntéza.Bylo zjištěno, že kyselina ursmonová, syntetický meziprodukt ursmonoamidu a jeho derivátů, inhibuje růst a klíčení oblíbené modelové rostliny Arabidopsis thaliana.Ve studii vztahu struktura-aktivita jsme zjistili, že sloučenina s C9 modifikovaným na kyselinu ursonovou, nazývaná nonyloxyderivát kyseliny ursonové (KAND), významně zvyšuje inhibiční účinek na růst a klíčení.Je pozoruhodné, že nově objevený inhibitor růstu rostlin také ovlivnil růst tabáku a jaterníku a nebyl cytotoxický pro bakterie nebo buňky HeLa.Navíc některé deriváty kyseliny urmotonové vyvolávají deformovaný fenotyp kořene, což znamená, že tyto deriváty přímo nebo nepřímo ovlivňují mikrotubuly.V souladu s touto myšlenkou naše pozorování mikrotubulů značených buď imunohistochemicky nebo fluorescenčními proteiny naznačují, že ošetření KAND depolymerizuje mikrotubuly.Navíc ošetření deriváty kyseliny kumamotonové narušilo aktinová mikrofilamenta.Tak jsme objevili nový inhibitor růstu rostlin, jehož jedinečný mechanismus účinku zahrnuje destrukci cytoskeletu.
Kmen MK493-CF1 byl izolován z půdy v Shinagawa-ku, Tokio.Kmen MK493-CF1 vytvořil dobře rozvětvené stromální mycelium.Byla stanovena částečná sekvence genu 16S ribozomální RNA (1422 bp).Tento kmen je velmi podobný S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typický kmen, 99,93 %).Na základě tohoto výsledku bylo stanoveno, že tento kmen byl blízce příbuzný typovému kmeni S. werraensis.Proto jsme tento kmen prozatímně pojmenovali S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T také produkuje stejné bioaktivní sloučeniny.Vzhledem k tomu, že bylo v raných fázích výzkumu získávání přírodních produktů z tohoto mikroorganismu málo, byl proveden další chemický výzkum.Po kultivaci S. werraensis MK493-CF1 na médiu ječmene fermentací v pevné fázi při 30 °C po dobu 14 dnů bylo médium extrahováno 50% EtOH.60 ml vzorku bylo vysušeno, čímž bylo získáno 59,5 mg surového extraktu.Surový extrakt byl podroben HPLC s reverzní fází, čímž byl získán N-methoxy-lH-pyrrol-2-karboxamid (1, nazvaný kumamonamid, 36,0 mg).Celkové množství 1 je přibližně 60 % surového extraktu.Proto jsme se rozhodli podrobně prostudovat vlastnosti kumamotoamidu 1.
Kumamonamid 1 je bílý amorfní prášek a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRESIMS) potvrzuje C6H8N2O2 (obr. 1).C2-substituovaný pyrrolový fragment této sloučeniny je charakterizován 5H 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), 5H 6,78 (1H, d, J = 2,5, 5H v 1H NMR spektru: 4,5 Hz , H-5) a 5H 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) a 13C NMR spektrum ukazuje přítomnost čtyř sp2 atomů uhlíku.Přítomnost amidové skupiny v poloze C2 byla hodnocena pomocí HMBC korelace od C-3 protonu k amidovému karbonylovému uhlíku při 5C 161,1.Navíc1H a13C NMR píky při 5H 4,10 (3H, S) a 5C 68,3 indikují přítomnost N-methoxy skupin v molekule.Ačkoli správná poloha methoxy skupiny dosud nebyla stanovena pomocí spektroskopické analýzy, jako je vylepšená diferenční spektroskopie a jaderná Overhauserova zkratka (NOEDF), N-methoxy-lH-pyrrol-2-karboxamid se stal první kandidátní sloučeninou.
Pro určení správné struktury 1 byla provedena celková syntéza (obr. 2a).Zpracování komerčně dostupného 2-aminopyridinu 2 s m-CPBA vedlo k odpovídajícímu N-oxidu 3 v kvantitativním výtěžku.Po 2-aminoazidaci sloučeniny 2 byla provedena cyklokondenzační reakce popsaná Abramovichem v benzenu při 90 °C za získání požadovaného l-hydroxy-lH-pyrrol-2-karbonitrilu 5 v gramech.Rychlost 60% (dvě stupně).15,16.Methylace a hydrolýza 4 pak poskytla l-methoxy-lH-pyrrol-2-karboxylovou kyselinu (nazývanou „kumotonová kyselina“, 6) v dobrém výtěžku (70 %, dva kroky).Nakonec amidace přes kyselý chloridový meziprodukt 6 za použití vodného amoniaku poskytla Kumamoto amid 1 v 98% výtěžku.Všechna spektrální data syntetizované 1 byla podobná izolované 1, takže byla určena struktura 1;
Obecná syntéza a analýza biologické aktivity urbenamidu a kyseliny urbenové.(a) Celková syntéza Kumamoto amidu.(b) Sedm dní staré semenáčky divokého typu Arabidopsis Columbia (Col) byly pěstovány na miskách Murashige a Skoog (MS) obsahujících kumamonamid 6 nebo kumamonamid 1 v uvedených koncentracích.Měřítko = 1 cm.
Nejprve jsme hodnotili biologické aktivity urbenamidu a jeho meziproduktů z hlediska jejich schopnosti modulovat růst rostlin.Do MS agarového média jsme přidali různé koncentrace ursmonamidu 1 nebo kyseliny ursmonové 6 a na tomto médiu kultivovali semenáčky Arabidopsis thaliana.Tyto testy ukázaly, že vysoké koncentrace (500 μM) 6 inhibovaly růst kořenů (obr. 2b).Dále jsme vytvořili různé deriváty substitucí N1 pozice 6 a provedli jsme na nich studie vztahu mezi strukturou a aktivitou (proces analogové syntézy je popsán v podpůrných informacích (SI)).Sazenice Arabidopsis byly pěstovány na médiu obsahujícím 50 uM derivátů kyseliny ursonové a byla měřena délka kořenů.jak je znázorněno na obrázku.Jak je znázorněno na obrázcích 3a, b a SI, kumamokyseliny mají různé délky lineárních alkoxylových řetězců (9, 10, 11, 12 a 13) nebo velkých alkoxylových řetězců (15, 16 a 17) v poloze N1.Deriváty vykazovaly významnou inhibici růstu kořenů.Kromě toho jsme zjistili, že aplikace 200 μM 10, 11 nebo 17 inhibovala klíčení (obr. 3c a S2).
Studium vztahu struktura-aktivita Kumamoto amidu a příbuzných sloučenin.(a) Struktura a schéma syntézy analogů.b) Kvantifikace délky kořenů 7 dnů starých sazenic pěstovaných na médiu MS s nebo bez 50 μM derivátů kumamonamidu.Hvězdičky označují významné rozdíly s předstíranou léčbou (t test, str< 0,05).n>18. Data jsou uvedena jako průměr ± SD.nt znamená „netestováno“, protože více než 50 % semen nevyklíčilo.(c) Kvantifikace rychlosti klíčení ošetřených semen inkubovaných po dobu 7 dnů v médiu MS s nebo bez 200 μM kumamonamidu a příbuzných sloučenin.Hvězdičky označují významné rozdíly s předstíranou léčbou (chí-kvadrát test).n=96.
Je zajímavé, že přidání alkylových postranních řetězců delších než C9 snížilo inhibiční aktivitu, což naznačuje, že sloučeniny příbuzné kyselině kumamotové vyžadují postranní řetězce určité velikosti, aby projevily svou biologickou aktivitu.
Protože analýza vztahu mezi strukturou a aktivitou ukázala, že C9 byl modifikován na kyselinu ursonovou a nonyloxyderivát kyseliny ursonové (dále označovaný jako KAND 11) byl nejúčinnějším inhibitorem růstu rostlin, provedli jsme podrobnější charakterizaci KAND 11. Léčba Arabidopsis s 50 μM KAND 11 téměř úplně zabránily klíčení, zatímco nižší koncentrace (40, 30, 20 nebo 10 μM) KAND 11 inhibovaly růst kořenů v závislosti na dávce (obr. 4a, b).Abychom otestovali, zda KAND 11 ovlivňuje životaschopnost kořenových meristémů, zkoumali jsme kořenové meristémy obarvené propidium jodidem (PI) a měřili jsme velikost plochy meristému.Velikost meristému semenáčků pěstovaných na médiu obsahujícím 25 μM KAND-11 byla 151,1 ± 32,5 μm, zatímco velikost meristému semenáčků pěstovaných na kontrolním médiu obsahujícím DMSO byla 264,7 ± 30,8 μm (obr. 4c, d). , což naznačuje, že KAND-11 obnovuje buněčnou aktivitu.šíření.Kořenový meristém.V souladu s tím léčba KAND 11 snížila množství markeru buněčného dělení CDKB2;lp::CDKB2;1-GUS signálu v kořenovém meristému (obr. 4e)17.Tyto výsledky naznačují, že KAND 11 inhibuje růst kořenů snížením aktivity buněčné proliferace.
Analýza inhibičního účinku derivátů kyseliny urbenonové (urbenyloxyderiváty) na růst.(a) 7 dní staré sazenice Col divokého typu pěstované na miskách MS s uvedenými koncentracemi KAND 11. Měřítko = 1 cm.(b) Kvantifikace délky kořene.Písmena označují významné rozdíly (Tukey HSD test, str< 0,05).n>16. Data jsou uvedena jako průměr ± SD.(c) Konfokální mikroskopie propidium jodidem obarvených kořenů Col divokého typu pěstovaných na miskách MS s nebo bez 25 μM KAND 11. Bílé závorky označují kořenový meristém.Měřítko = 100 um.d) Kvantifikace velikosti kořenového meristému (n = 10 až 11).Statistické rozdíly byly stanoveny pomocí t-testu (str< 0,05).Sloupce představují průměrnou velikost meristému.(e) Diferenční interferenční kontrastní (DIC) mikroskopie kořenového meristému obsahujícího konstrukt CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS barveno a barveno na 5 dnů starých semenácích pěstovaných na MS destičkách s nebo bez 25 uM KAND testu.
Fytotoxicita KAND 11 byla dále testována pomocí další dvouděložné rostliny, tabáku (Nicotiana tabacum), a hlavního modelového organismu suchozemských rostlin, jaterníku (Marchantia polymorpha).Stejně jako v případě Arabidopsis, semenáčky tabáku SR-1 pěstované na médiu obsahujícím 25 μM KAND 11 produkovaly kratší kořeny (obr. 5a).Navíc 40 ze 48 semen vyklíčilo na miskách obsahujících 200 μM KAND 11, zatímco všech 48 semen vyklíčilo na falešně ošetřeném médiu, což naznačuje, že vyšší koncentrace KAND byly významné (p< 0,05;chi test -čtverec) inhiboval klíčení tabáku.(obr. 5b).Navíc koncentrace KAND 11, která inhibovala bakteriální růst v játrově, byla podobná účinné koncentraci u Arabidopsis (obr. 5c).Tyto výsledky naznačují, že KAND 11 může inhibovat růst různých rostlin.Poté jsme zkoumali možnou cytotoxicitu sloučenin příbuzných medvědím monoamidům u jiných organismů, jmenovitě u lidských buněk HeLa a kmene Escherichia coli DH5α, jako zástupců vyšších živočišných a bakteriálních buněk.V sérii testů buněčné proliferace jsme pozorovali, že kumamonamid 1, kyselina kumamonamidová 6 a KAND 11 neovlivnily růst buněk HeLa nebo E. coli v koncentracích 100 uM (obr. 5d,e).
Inhibice růstu KAND 11 u nearabidopsis organismů.(a) Dvoutýdenní sazenice tabáku SR-1 divokého typu byly pěstovány na vertikálně umístěných miskách MS obsahujících 25 μM KAND 11. (b) Dvoutýdenní sazenice tabáku SR-1 divokého typu byly pěstovány na vodorovně umístěných Misky MS obsahující 200 μM KAND 11. (c) Dva týdny staré pupeny jaterníku Tak-1 divokého typu pěstované na plotnách Gamborg B5 s uvedenými koncentracemi KAND 11. Červené šipky označují spory, které přestaly růst během dvoutýdenní inkubace doba.(d) Test buněčné proliferace buněk HeLa.Počet životaschopných buněk byl měřen v pevných časových intervalech pomocí soupravy pro počítání buněk 8 (Dojindo).Jako kontrola byly HeLa buňky ošetřeny 5 μg/ml aktinomycinu D (Act D), který inhibuje transkripci RNA polymerázy a způsobuje buněčnou smrt.Analýzy byly provedeny trojmo.(e) Test proliferace buněk E. coli.Růst E. coli byl analyzován měřením OD600.Jako kontrola byly buňky ošetřeny 50 μg/ml ampicilinu (Amp), který inhibuje syntézu bakteriální buněčné stěny.Analýzy byly provedeny trojmo.
Abychom dešifrovali mechanismus účinku cytotoxicity způsobené sloučeninami podobnými uramidu, znovu jsme analyzovali deriváty kyseliny urbenové se středními inhibičními účinky.jak je znázorněno na obrázku.Jak je znázorněno na obrázcích 2b, 6a, sazenice pěstované na agarových plotnách obsahujících vysoké koncentrace (200 μM) kyseliny urmotonové 6 produkovaly kratší a doleva zakřivené kořeny (θ = – 23,7 ± 6,1), zatímco sazenice pěstované na kontrolním médiu sazenice produkovaly téměř rovné kořeny (θ = – 3,8 ± 7,1).Je známo, že tento charakteristický šikmý růst je výsledkem dysfunkce kortikálních mikrotubulů14,18.V souladu s tímto zjištěním léky destabilizující mikrotubuly disopyramid a oryzalin vyvolaly podobné naklánění kořenů za našich růstových podmínek (obr. 2b, 6a).Současně jsme testovali deriváty kyseliny urmotonové a vybrali jsme několik z nich, které v určitých koncentracích vyvolávaly růst šikmých kořenů.Sloučeniny 8, 9 a 15 změnily směr růstu kořenů při 75 μM, 50 μM a 40 μM, v daném pořadí, což ukazuje, že tyto sloučeniny mohou účinně destabilizovat mikrotubuly (obr. 2b, 6a).Testovali jsme také nejúčinnější derivát kyseliny ursolové, KAND 11, v nižší koncentraci (15 µM) a zjistili jsme, že aplikace KAND 11 inhibovala růst kořenů a že směr růstu kořenů byl nerovnoměrný, i když měly tendenci se svažovat doleva ( Obrázek C3)..Protože vyšší koncentrace léčiv destabilizujících mikrotubuly někdy spíše inhibují růst rostlin než způsobují naklánění kořenů, následně jsme vyhodnotili možnost, že KAND 11 ovlivňuje mikrotubuly pozorováním kortikálních mikrotubulů v epidermálních buňkách kořene.Imunohistochemie s použitím anti-β-tubulinových protilátek v epidermálních buňkách kořenů semenáčků ošetřených 25 μM KAND 11 ukázala vymizení téměř všech kortikálních mikrotubulů v epidermálních buňkách v elongační zóně (obr. 6b).Tyto výsledky naznačují, že kyselina kumamotonová a její deriváty působí přímo nebo nepřímo na mikrotubuly, aby je narušily, a že tyto sloučeniny jsou novými inhibitory mikrotubulů.
Kyselina ursonová a její deriváty mění kortikální mikrotubuly v Arabidopsis thaliana.(a) Úhel sklonu kořene měřený v přítomnosti různých derivátů kyseliny urmotonové v uvedených koncentracích.Byly také analyzovány účinky dvou sloučenin, o kterých je známo, že inhibují mikrotubuly: disopyramidu a oryzalinu.Vložka ukazuje standard používaný k měření úhlu růstu kořene.Hvězdičky označují významné rozdíly s předstíranou léčbou (t test, str< 0,05).n>19. Měřítko = 1 cm.(b) Kortikální mikrotubuly v epidermálních buňkách v elongační zóně.Mikrotubuly v kořenech Arabidopsis Col divokého typu pěstovaných na miskách MS s nebo bez 25 μM KAND 11 byly vizualizovány imunohistochemickým barvením pomocí primárních protilátek β-tubulinu a sekundárních protilátek konjugovaných s Alexa Fluor.Měřítko = 10 um.(c) Mitotická struktura mikrotubulů v kořenovém meristému.Mikrotubuly byly vizualizovány pomocí imunohistochemického barvení.Mitotické struktury, včetně profázních zón, vřetének a fragmoplastů, byly spočítány z konfokálních snímků.Šipky označují struktury mitotických mikrotubulů.Hvězdičky označují významné rozdíly s předstíranou léčbou (t test, str< 0,05).n>9. Měřítko = 50 um.
Přestože má Ursa schopnost narušit funkci mikrotubulů, očekává se, že její mechanismus účinku bude odlišný od typických depolymerizačních činidel pro mikrotubuly.Například vyšší koncentrace činidel depolymerujících mikrotubuly, jako je disopyramid a oryzalin, indukují anizotropní expanzi epidermálních buněk, zatímco KAND 11 nikoli.Kromě toho, co-aplikace KAND 11 a disopyramid vedlo v kombinované disopyramide-indukované kořenové růstové odpovědi a KAND 11-indukované inhibice růstu byla pozorována (obr. S4).Také jsme analyzovali odpověď hypersenzitivní mutanty disopyramidu 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 má nekanonickou bodovou mutaci tubulinkinázy a při ošetření disopyramidem produkuje kratší kořeny9,20.Sazenice mutantu phs1-1 pěstované na agarovém médiu obsahujícím KAND 11 měly kratší kořeny podobné těm, které rostly na disopyramidě (obr. S5).
Kromě toho jsme pozorovali mitotické mikrotubulové struktury, jako jsou profázní zóny, vřeténka a fragmoplasty, v kořenovém meristému sazenic ošetřených KAND 11. V souladu s pozorováním pro CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS došlo k významnému snížení byl pozorován počet mitotických mikrotubulů (obr. .6c).
Abychom charakterizovali cytotoxicitu KAND 11 při subcelulárním rozlišení, ošetřili jsme buňky suspenze tabáku BY-2 pomocí KAND 11 a pozorovali jsme jejich odpověď.Nejprve jsme přidali KAND 11 k buňkám BY-2 exprimujícím TagRFP-TUA6, který fluorescenčně značí mikrotubuly, abychom vyhodnotili účinek KAND 11 na kortikální mikrotubuly.Hustota kortikálních mikrotubulů byla hodnocena pomocí analýzy obrazu, která kvantifikovala procento cytoskeletálních pixelů mezi cytoplazmatickými pixely.Výsledky testu ukázaly, že po ošetření 50 μM nebo 100 μM KAND 11 po dobu 1 hodiny se hustota významně snížila na 0,94 ± 0,74 % nebo 0,23 ± 0,28 %, v tomto pořadí, zatímco hustota buněk ošetřených DMSO činila 1,61 ± 0,34 % (obr. 7a).Tyto výsledky jsou v souladu s pozorováním u Arabidopsis, že léčba KAND 11 indukuje depolymerizaci kortikálních mikrotubulů (obr. 6b).Také jsme zkoumali linii BY-2 s aktinovými vlákny značenými GFP-ABD po ošetření stejnou koncentrací KAND 11 a pozorovali jsme, že ošetření KAND 11 narušilo aktinová vlákna.Ošetření 50 μM nebo 100 μM KAND 11 po dobu 1 hodiny významně snížilo hustotu aktinových filamentů na 1,20 ± 0,62 %, respektive 0,61 ± 0,26 %, zatímco hustota v buňkách ošetřených DMSO byla 1,69 ± 0,51 % (obr. 2).7b).Tyto výsledky kontrastují s účinky propyzamidu, který neovlivňuje aktinová vlákna, a latrunculinu B, depolymerizéru aktinu, který neovlivňuje mikrotubuly (SI obrázek S6).Kromě toho léčba kumamonamidem 1, kumamonamidem kyseliny 6 nebo KAND 11 neovlivnila mikrotubuly v buňkách HeLa (SI obrázek S7).Předpokládá se tedy, že mechanismus účinku KAND 11 je odlišný od mechanismu známých disruptorů cytoskeletu.Kromě toho naše mikroskopické pozorování buněk BY-2 ošetřených KAND 11 odhalilo počátek buněčné smrti během ošetření KAND 11 a ukázalo, že podíl mrtvých buněk zbarvených Evansovou modří se významně nezvýšil po 30 minutách ošetření KAND 11, zatímco po 90 minutách působení 50 μM nebo 100 μM KAND se počet mrtvých buněk zvýšil na 43,7 %, respektive 80,1 % (obr. 7c).Celkově vzato tato data naznačují, že nový derivát kyseliny ursolové KAND 11 je rostlinně specifický cytoskeletální inhibitor s dosud neznámým mechanismem účinku.
KAND ovlivňuje kortikální mikrotubuly, aktinová vlákna a životaschopnost buněk tabáku BY-2.(a) Vizualizace kortikálních mikrotubulů v buňkách BY-2 v přítomnosti TagRFP-TUA6.Buňky BY-2 ošetřené KAND 11 (50 μM nebo 100 μM) nebo DMSO byly zkoumány konfokální mikroskopií.Hustota kortikálních mikrotubulů byla vypočtena z mikrofotografie 25 nezávislých buněk.Písmena označují významné rozdíly (Tukey HSD test, str< 0,05).Měřítko = 10 um.(b) Kortikální aktinová vlákna v buňkách BY-2 vizualizovaná v přítomnosti GFP-ABD2.Buňky BY-2 ošetřené KAND 11 (50 μM nebo 100 μM) nebo DMSO byly zkoumány konfokální mikroskopií.Hustota kortikálních aktinových vláken byla vypočtena z mikrofotografie 25 nezávislých buněk.Písmena označují významné rozdíly (Tukey HSD test, str< 0,05).Měřítko = 10 um.(c) Pozorování mrtvých buněk BY-2 barvením Evansovou modří.Buňky BY-2 ošetřené KAND 11 (50 μM nebo 100 μM) nebo DMSO byly zkoumány mikroskopií ve světlém poli.n=3.Měřítko = 100 um.
Objev a aplikace nových přírodních produktů vedly k významným pokrokům v různých aspektech lidského života, včetně medicíny a zemědělství.Byl proveden historický výzkum s cílem získat užitečné sloučeniny z přírodních zdrojů.Zejména je známo, že aktinomycety jsou užitečné jako antiparazitická antibiotika pro háďátka díky své schopnosti produkovat různé sekundární metabolity, jako je avermektin, hlavní sloučenina ivermektinu a bleomycin a jeho deriváty, používané v lékařství jako protirakovinné činidlo21,22.Podobně byly z aktinomycet objeveny různé herbicidní sloučeniny, z nichž některé jsou již komerčně využívány1,23.Proto je analýza metabolitů aktinomycet za účelem izolace přírodních produktů s požadovanými biologickými aktivitami považována za účinnou strategii.V této studii jsme objevili novou sloučeninu, kumamonamid, ze S. werraensis a úspěšně ji syntetizovali.Kyselina ursonová je syntetický meziprodukt urbenamidu a jeho derivátů.Může způsobit charakteristické svinování kořenů, vykazovat střední až silnou herbicidní aktivitu a přímo nebo nepřímo poškozovat rostlinné mikrotubuly.Mechanismus účinku kyseliny urmotonové se však může lišit od mechanismu stávajících inhibitorů mikrotubulů, protože KAND 11 také narušuje aktinová vlákna a způsobuje buněčnou smrt, což naznačuje regulační mechanismus, kterým kyselina urmotonová a její deriváty ovlivňují širokou škálu cytoskeletálních struktur..
Další podrobná charakterizace kyseliny urbenonové pomůže lépe porozumět mechanismu účinku kyseliny urbenonové.Dalším cílem je zejména vyhodnotit schopnost kyseliny ursonové vázat se na redukované mikrotubuly a určit, zda kyselina ursonová a její deriváty působí přímo na mikrotubuly a depolymerují je, nebo zda jejich působení vede k destabilizaci mikrotubulů.Navíc v případě, kdy mikrotubuly nejsou přímým cílem, identifikace místa působení a molekulárních cílů kyseliny ursonové na rostlinných buňkách pomůže dále porozumět vlastnostem příbuzných sloučenin a možným způsobům, jak zlepšit herbicidní aktivitu.Náš test bioaktivity odhalil jedinečnou cytotoxickou schopnost kyseliny ursonové na růst rostlin, jako je Arabidopsis thaliana, tabák a jaterník, zatímco buňky E. coli ani HeLa nebyly ovlivněny.Malá nebo žádná toxicita pro živočišné buňky je výhodou derivátů kyseliny ursonové, pokud jsou vyvinuty jako herbicidy pro použití na otevřených zemědělských polích.Protože mikrotubuly jsou běžnými strukturami u eukaryot, je jejich selektivní inhibice v rostlinách klíčovým požadavkem na herbicidy.Například propyzamid, činidlo depolymerující mikrotubuly, které se přímo váže na tubulin a inhibuje polymeraci, se používá jako herbicid kvůli své nízké toxicitě pro živočišné buňky24.Na rozdíl od disopyramidu mají příbuzné benzamidy různé cílové specifity.Kromě rostlinných mikrotubulů inhibuje RH-4032 nebo benzoxamid také mikrotubuly živočišných buněk, respektive oomycetů, a zalilamid se používá jako fungicid pro svou nízkou fytotoxicitu25,26,27.Nově objevený medvěd a jeho deriváty vykazují selektivní cytotoxicitu vůči rostlinám, ale stojí za zmínku, že další modifikace mohou změnit jejich cílovou specifitu a potenciálně poskytnout další deriváty pro kontrolu patogenních hub nebo oomycet.
Jedinečné vlastnosti kyseliny urbenonové a jejích derivátů jsou užitečné pro jejich vývoj jako herbicidů a použití jako výzkumných nástrojů.Význam cytoskeletu při kontrole tvaru rostlinných buněk je široce uznáván.Dřívější studie ukázaly, že rostliny si vyvinuly složité mechanismy organizace kortikálních mikrotubulů řízením dynamiky mikrotubulů, aby správně řídily morfogenezi.Bylo identifikováno velké množství molekul odpovědných za regulaci aktivity mikrotubulů a související výzkum stále probíhá3,4,28.Naše současné chápání dynamiky mikrotubulů v rostlinných buňkách plně nevysvětluje mechanismy organizace kortikálních mikrotubulů.Například, ačkoli jak disopyramid, tak oryzalin mohou depolymerovat mikrotubuly, disopyramid způsobuje závažnou deformaci kořenů, zatímco oryzalin má relativně mírný účinek.Navíc mutace v tubulinu, který stabilizuje mikrotubuly, také způsobují pravotočivost kořenů, zatímco paclitaxel, který také stabilizuje dynamiku mikrotubulů, nikoli.Studium a identifikace molekulárních cílů kyseliny ursolové by proto mělo poskytnout nový pohled na regulaci rostlinných kortikálních mikrotubulů.Stejně tak budoucí srovnání chemikálií, které jsou účinné při podpoře narušeného růstu, jako je disopyramid, a méně účinných chemikálií, jako je oryzalin nebo kyselina kumamotorová, poskytnou vodítka k tomu, jak dochází ke zkreslenému růstu.
Na druhou stranu cytoskeletální přestavby související s obranou jsou další možností, jak vysvětlit cytotoxicitu kyseliny ursonové.Infekce patogenem nebo zavedení elicitoru do rostlinných buněk někdy způsobí destrukci cytoskeletu a následnou buněčnou smrt29.Například bylo hlášeno, že kryptoxanthin pocházející z oomycet narušuje mikrotubuly a aktinová vlákna před smrtí tabákových buněk, podobně jako při léčbě KAND30,31.Podobnosti mezi obrannými reakcemi a buněčnými reakcemi vyvolanými kyselinou ursonovou nás vedly k hypotéze, že spouštějí běžné buněčné procesy, i když je evidentní rychlejší a silnější účinek kyseliny ursonové než kryptoxantinu.Studie však ukázaly, že narušení aktinových filament podporuje spontánní buněčnou smrt, která není vždy doprovázena narušením mikrotubulů29.Kromě toho zbývá zjistit, zda buď patogen nebo elicitor způsobuje zkreslený růst kořenů, jako to dělají deriváty kyseliny ursonové.Molekulární znalosti spojující obranné reakce a cytoskelet jsou tedy atraktivním problémem, který je třeba řešit.Využitím přítomnosti sloučenin s nízkou molekulovou hmotností souvisejících s kyselinou ursonovou, stejně jako řady derivátů s různou účinností, mohou poskytnout příležitosti k zacílení na neznámé buněčné mechanismy.
Dohromady, objev a aplikace nových sloučenin, které modulují dynamiku mikrotubulů, poskytne výkonné metody pro řešení složitých molekulárních mechanismů, které jsou základem určování tvaru rostlinných buněk.V této souvislosti může nedávno vyvinutá sloučenina kyselina urmotonová, která ovlivňuje mikrotubuly a aktinová vlákna a indukuje buněčnou smrt, poskytnout příležitost k dešifrování spojení mezi kontrolou mikrotubulů a těmito dalšími mechanismy.Chemická a biologická analýza pomocí kyseliny urbenonové nám tedy pomůže porozumět molekulárním regulačním mechanismům, které řídí rostlinný cytoskelet.
Naočkujte S. werraensis MK493-CF1 do 500 ml Erlenmeyerovy baňky s přepážkami obsahující 110 ml zárodečného média sestávajícího z 2 % (w/v) galaktózy, 2 % (w/v) Essence pasty, 1 % ( w/v) Bacto kompozice .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) kukuřičný extrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonsko), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4 a 0,2 % CaC03 v deionizované vodě.(pH 7,4 před sterilizací).Očkovací kultury byly inkubovány na rotační třepačce (180 ot./min.) při 27 °C po dobu 2 dnů.Produkční kultivace prostřednictvím fermentace v pevné fázi.Očkovací kultura (7 ml) byla přenesena do 500 ml K-1 baňky obsahující 40 g produkčního média sestávajícího z 15 g lisovaného ječmene (MUSO Co., Ltd., Japonsko) a 25 g deionizované vody (pH neupraveno před sterilizací).).Fermentace byla prováděna při 30 °C ve tmě po dobu 14 dnů.Fermentační materiál byl extrahován 40 ml/lahev EtOH a centrifugován (1500 g, 4 °C, 10 min).Kultivační supernatant (60 ml) byl extrahován směsí 10% MeOH/EtOAc.Organická vrstva byla odpařena za sníženého tlaku, čímž byl získán zbytek (59,5 mg), který byl podroben HPLC s gradientovou elucí (0–10 minut: 90 %) na koloně s reverzní fází (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × délka 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minut: 90 % H2O/CH3CN až 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minut: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minut: 90 % H2O /EtOH až 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) při průtoku 1,5 ml/min byl izolován kumamonamid (1, 36,0 mg) jako bílý amorfní prášek.
kumamotoamid(1);'H-NMR (500 MHz, CDC13) 5 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1 H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ vypočtená hodnota: 141,0659, naměřená hodnota: 141,0663, IR vmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1,537 cm
Semena Columbia (Col-0) byla získána z Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) s povolením pro výzkumné použití.Semena Col-0 byla množena a udržována v našich laboratorních podmínkách a použita jako rostliny Arabidopsis divokého typu.Semena Arabidopsis byla povrchově sterilizována a kultivována v polovičním médiu Murashige a Skoog obsahujícím 2 % sacharózy (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (hm./obj.) 2-(4-morfolino)ethansulfonové kyseliny (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) a 1,5% agaru (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, při 23 °C a konstantním světle.Semena mutantu phsl-1 poskytl T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Semena kmene SR-1 poskytl T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) a použila se jako rostliny tabáku divokého typu.Semínka tabáku byla povrchově sterilizována a namočena ve sterilní vodě po dobu tří nocí, aby se podpořilo klíčení, poté byla umístěna do roztoku o poloviční síle obsahujícího 2 % sacharózy, 0,05 % (w/v) MES a 0,8 % gellanové gumy (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.a Skoog médium) s pH 5,7 a inkubovány při 23 °C za konstantního světla.
Kmen Tak-1 poskytl T. Kohchi (Kyoto University) a byl použit jako standardní experimentální jednotka pro studii jaterníku.Gemma byla získána ze sterilizovaných kultivovaných rostlin a poté nanesena na médium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) obsahující 1 % sacharózy a 0,3 % gumy gellan a inkubována při 23 °C za stálého světla.
Tabákové buňky BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) poskytl S. Hasezawa (University of Tokyo).Buňky BY-2 byly zředěny 95krát v modifikovaném Linsmeierově a Skoogově médiu a týdně doplněny kyselinou 2,4-dichlorfenoxyoctovou32.Buněčná suspenze byla míchána na rotační třepačce při 130 otáčkách za minutu při 27 °C ve tmě.Promyjte buňky 10násobným objemem čerstvého média a resuspendujte ve stejném médiu.Transgenní buněčné linie BY-2 stabilně exprimující mikrotubulový marker TagRFP-TUA6 nebo aktinový filamentový marker GFP-ABD2 pod promotorem 35S viru květákové mozaiky byly vytvořeny, jak je popsáno33,34,35.Tyto buněčné linie mohou být udržovány a synchronizovány pomocí postupů podobných těm, které byly použity pro původní buněčnou linii BY-2.
Buňky HeLa byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) (Life Technologies) doplněném 10% fetálním bovinním sérem, 1,2 U/ml penicilinu a 1,2 μg/ml streptomycinu v inkubátoru při 37 °C s 5 % CO2.
Všechny experimenty popsané v tomto rukopisu byly provedeny v souladu s japonskými předpisy a směrnicemi pro biologickou bezpečnost.
Sloučeniny byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) jako zásobní roztoky a zředěny v MS médiu pro Arabidopsis a tabák nebo Gamborg B5 médiu pro játrovku.Pro test inhibice růstu kořenů bylo více než 10 semen na misku vysety na agarové médium obsahující uvedené sloučeniny nebo DMSO.Semena byla inkubována v růstové komoře po dobu 7 dnů.Sazenice byly vyfotografovány a byla změřena délka kořenů.Pro test klíčení Arabidopsis bylo 48 semen na misku vysety na agarové médium obsahující 200 uM sloučeniny nebo DMSO.Semena Arabidopsis byla pěstována v růstové komoře a počet vyklíčených semenáčků byl spočítán 7 dní po vyklíčení (dag).Pro test klíčení tabáku bylo 24 semen na misku vysety na agarové médium obsahující 200 uM KAND nebo DMSO.Semena tabáku byla pěstována v růstové komoře a počet vyklíčených semenáčků byl spočítán po 14 dnech.Pro test inhibice růstu jaterníku bylo 9 embryí z každé plotny umístěno na agarové médium obsahující uvedené koncentrace KAND nebo DMSO a inkubováno v růstové komoře po dobu 14 dnů.
Použijte semenáčky obarvené 5 mg/ml propidium jodidu (PI) k vizualizaci organizace kořenových meristémů.PI signály byly pozorovány fluorescenční mikroskopií s použitím konfokálního laserového skenovacího mikroskopu TCS SPE (Leica Microsystems).
Histochemické barvení kořenů β-glukuronidázou (GUS) bylo provedeno podle protokolu popsaného Malami a Benfey36.Sazenice byly fixovány v 90% acetonu přes noc, obarveny 0,5 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-P-d-glukuronové kyseliny v GUS pufru po dobu 1 hodiny a umístěny do hydratovaného roztoku chloraldehydu.(8 g chloralhydrátu, 2 ml vody a 1 ml glycerolu) a pozorovány diferenciální interferenční kontrastní mikroskopií za použití mikroskopu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Úhly kořenů byly měřeny na 7denních sazenicích pěstovaných na vertikálně umístěných miskách.Změřte úhel kořene ze směru vektoru gravitace, jak je popsáno v kroku 6.
Uspořádání kortikálních mikrotubulů bylo pozorováno, jak je popsáno, s menšími úpravami protokolu37.Anti-β-tubulinová protilátka (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) a Alexa Fluor 488-konjugovaný anti-myší IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) byly použity jako primární a sekundární protilátky v ředění 1:1000 a 1:100, respektive.Fluorescenční snímky byly získány pomocí TCS SPE konfokálního laserového skenovacího mikroskopu (Leica Microsystems).Získejte snímky Z-stack a vytvořte projekce maximální intenzity podle pokynů výrobce.
Test proliferace buněk HeLa byl proveden za použití sady Cell Counting Kit 8 (Dojindo) podle pokynů výrobce.
Růst E. coli DH5a byl analyzován měřením buněčné hustoty v kultuře za použití spektrofotometru při 600 nm (OD600).
Cytoskeletální organizace v transgenních BY-2 buňkách byla pozorována pomocí fluorescenčního mikroskopu vybaveného konfokálním skenovacím zařízením CSU-X1 (Yokogawa) a sCMOS kamerou (Zyla, Andor Technology).Cytoskeletální hustota byla hodnocena obrazovou analýzou, která kvantifikovala procento cytoskeletálních pixelů mezi cytoplazmatickými pixely v konfokálních snímcích pomocí softwaru ImageJ, jak je popsáno38,39.
Pro detekci buněčné smrti v buňkách BY-2 byl alikvot buněčné suspenze inkubován s 0,05% Evansovou modří po dobu 10 minut při teplotě místnosti.Selektivní barvení mrtvých buněk Evansovou modří závisí na vytlačování barviva z životaschopných buněk intaktní plazmatickou membránou40.Obarvené buňky byly pozorovány pomocí mikroskopu s jasným polem (BX53, Olympus).
HeLa buňky byly pěstovány v DMEM doplněném 10% FBS ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C a 5% C02.Buňky byly ošetřeny 100 uM KAND 11, kyselinou kumamonamovou 6, kumamonamidem 1, 100 ng/ml colcemidem (Gibco) nebo 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) po dobu 6 hodin při 37 °C.Buňky byly fixovány MetOH po dobu 10 minut a poté acetátem po dobu 5 minut při teplotě místnosti.Fixované buňky byly inkubovány s primární protilátkou p-tubulinu (1D4A4, Proteintech: 66240-1) zředěnou v 0,5% BSA/PBS po dobu 2 hodin, promyty 3krát TBST a poté inkubovány s kozí protilátkou Alexa Fluor.488 1 hodina.– Myší IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) a 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) zředěné v 0,5% BSA/PBS.Po trojnásobném promytí TBST byly obarvené buňky pozorovány na inverzním mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E.Snímky byly pořízeny chlazenou CCD kamerou Hamamatsu ORCA-R2 pomocí softwaru MetaMorph (Molecular Devices).
Čas odeslání: 17. června 2024