Efektivněkontrola komárůa snížit výskyt nemocí, které přenášejí, jsou zapotřebí strategické, udržitelné a ekologicky šetrné alternativy k chemickým pesticidům. Vyhodnotili jsme semenné moučky z některých druhů čeledi Brassicaceae (čeleď Brassica) jako zdroj rostlinných isothiokyanátů produkovaných enzymatickou hydrolýzou biologicky neaktivních glukosinolátů pro použití v boji proti egyptskému Aedes (L., 1762). Pětinásobně odtučněná semenná moučka (Brassica juncea (L.) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 a Thlaspi arvense – tři hlavní typy tepelné inaktivace a enzymatické degradace. Chemické produkty: Stanovení toxicity (LC50) allylisothiokyanátu, benzyllisothiokyanátu a 4-hydroxybenzyllisothiokyanátu pro larvy Aedes aegypti při 24hodinové expozici = 0,04 g/120 ml dH2O). Hodnoty LC50 pro moučku ze semen hořčice, hořčice bílé a přesličky byly 0,05, 0,08 a 0,05 v porovnání s allylisothiokyanátem (LC50 = 19,35 ppm) a 4,2-hydroxybenzylisothiokyanátem (LC50 = 55,41 ppm) který byl pro larvy toxičtější do 24 hodin po ošetření než 0,1 g/120 ml dH2O. Tyto výsledky jsou v souladu s produkcí moučky ze semen vojtěšky. Vyšší účinnost benzylesterů odpovídá vypočítaným hodnotám LC50. Použití moučky ze semen může poskytnout účinnou metodu hubení komárů. Studie popisuje účinnost prášku ze semen brukvovitých a jeho hlavních chemických složek proti larvám komárů a ukazuje, jak mohou přírodní sloučeniny v prášku ze semen brukvovitých sloužit jako slibný ekologický larvicid pro hubení komárů.
Nemoci přenášené vektory způsobené komáry rodu Aedes zůstávají závažným globálním problémem veřejného zdraví. Výskyt nemocí přenášených komáry se geograficky šíří1,2,3 a znovu se objevuje, což vede k propuknutí závažných onemocnění4,5,6,7. Šíření nemocí mezi lidmi a zvířaty (např. chikungunya, dengue, horečka Rift Valley, žlutá zimnice a virus Zika) je bezprecedentní. Jen horečka dengue vystavuje v tropech riziku infekce přibližně 3,6 miliardy lidí, přičemž ročně dochází k odhadovaným 390 milionům infekcí, což má za následek 6 100–24 300 úmrtí ročně8. Znovuobjevení a propuknutí viru Zika v Jižní Americe přitáhlo celosvětovou pozornost kvůli poškození mozku, které způsobuje u dětí narozených nakaženým ženám2. Kremer a kol.3 předpovídají, že geografický rozsah komárů rodu Aedes se bude dále rozšiřovat a že do roku 2050 bude polovina světové populace ohrožena infekcí arboviry přenášenými komáry.
S výjimkou nedávno vyvinutých vakcín proti horečce dengue a žluté zimnici dosud nebyly vyvinuty vakcíny proti většině nemocí přenášených komáry9,10,11. Vakcíny jsou stále dostupné v omezeném množství a používají se pouze v klinických studiích. Kontrola přenašečů komárů pomocí syntetických insekticidů je klíčovou strategií pro kontrolu šíření nemocí přenášených komáry12,13. Ačkoli syntetické pesticidy účinně hubí komáry, pokračující používání syntetických pesticidů negativně ovlivňuje necílové organismy a znečišťuje životní prostředí14,15,16. Ještě alarmující je trend rostoucí rezistence komárů vůči chemickým insekticidům17,18,19. Tyto problémy spojené s pesticidy urychlily hledání účinných a ekologicky šetrných alternativ ke kontrole přenašečů nemocí.
Různé rostliny byly vyvinuty jako zdroje fytopesticidů pro hubení škůdců20,21. Rostlinné látky jsou obecně šetrné k životnímu prostředí, protože jsou biologicky odbouratelné a mají nízkou nebo zanedbatelnou toxicitu pro necílové organismy, jako jsou savci, ryby a obojživelníci20,22. Je známo, že bylinné přípravky produkují řadu bioaktivních sloučenin s různými mechanismy účinku, které účinně kontrolují různá životní stádia komárů23,24,25,26. Sloučeniny rostlinného původu, jako jsou esenciální oleje a další aktivní rostlinné složky, si získaly pozornost a vydláždily cestu inovativním nástrojům pro kontrolu přenašečů komárů. ESENCIÁLNÍ OLEJE, MONOTERPENY A SESKVITERPENY působí jako repelenty, odstrašující prostředky proti potravě a ovicidy27,28,29,30,31,32,33. Mnoho rostlinných olejů způsobuje smrt larev, kukel a dospělých komárů34,35,36 a ovlivňuje nervový, dýchací, endokrinní a další důležité systémy hmyzu37.
Nedávné studie poskytly vhled do potenciálního využití rostlin hořčice a jejich semen jako zdroje bioaktivních sloučenin. Hořčičná moučka byla testována jako biofumigant38,39,40,41 a používána jako půdní doplňková látka pro potlačení plevele42,43,44 a kontrolu půdních rostlinných patogenů45,46,47,48,49,50, výživu rostlin, hlístic 41,51, 52, 53, 54 a škůdců 55, 56, 57, 58, 59, 60. Fungicidní aktivita těchto prášků ze semen se připisuje ochranným sloučeninám rostlin zvaným isothiokyanáty38,42,60. V rostlinách jsou tyto ochranné sloučeniny uloženy v rostlinných buňkách ve formě nebioaktivních glukosinolátů. Pokud jsou však rostliny poškozeny hmyzem nebo infekcí patogeny, glukosinoláty jsou hydrolyzovány myrosinázou na bioaktivní isothiokyanáty55,61. Isothiokyanáty jsou těkavé sloučeniny, o nichž je známo, že mají širokospektrální antimikrobiální a insekticidní účinek, a jejich struktura, biologická aktivita a obsah se u jednotlivých druhů čeledi Brassicaceae značně liší42,59,62,63.
Ačkoli je známo, že isothiokyanáty získané z hořčičné moučky mají insekticidní účinek, chybí údaje o biologické aktivitě proti lékařsky významným přenašečům členovců. Naše studie zkoumala larvicidní účinek čtyř odtučněných prášků ze semen proti komárům rodu Aedes. Larvy Aedes aegypti. Cílem studie bylo zhodnotit jejich potenciální využití jako ekologicky šetrných biopesticidů pro hubení komárů. Byly také testovány tři hlavní chemické složky moučky ze semen, allylisothiokyanát (AITC), benzyllisothiokyanát (BITC) a 4-hydroxybenzyllisothiokyanát (4-HBITC), aby se ověřila biologická aktivita těchto chemických složek na larvy komárů. Toto je první zpráva, která hodnotí účinnost čtyř prášků ze semen zelí a jejich hlavních chemických složek proti larvám komárů.
Laboratorní kolonie Aedes aegypti (kmen Rockefeller) byly udržovány při teplotě 26 °C, 70% relativní vlhkosti (RH) a 10:14 h (fotoperioda L:D). Spářené samice byly umístěny v plastových klecích (výška 11 cm a průměr 9,5 cm) a krmeny systémem krmení z lahve s citrátovou bovinní krví (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Krmení krví probíhalo obvyklým způsobem pomocí membránového víceskleněného krmítka (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) připojeného k cirkulační vodní lázni (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) s regulací teploty 37 °C. Na dno každé skleněné krmné komory (plocha 154 mm2) byla natažena fólie Parafilm M. Každé krmítko bylo poté umístěno na horní mřížku zakrývající klec s pářící se samicí. Do skleněného krmného trychtýře bylo pomocí Pasteurovy pipety (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) přidáno přibližně 350–400 μl hovězí krve a dospělí červi byli ponecháni alespoň jednu hodinu okapat. Březí samičky poté dostaly 10% roztok sacharózy a nechaly se naklást vajíčka na vlhký filtrační papír vyložený v jednotlivých ultraprůhledných kelímcích na suflé (o objemu 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Filtrační papír s vajíčky umístěte do uzavřeného sáčku (SC Johnsons, Racine, WI) a skladujte při teplotě 26 °C. Vajíčka se vylíhla a přibližně 200–250 larev bylo odchováno v plastových miskách obsahujících směs králičí stravy (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) a jaterního prášku (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA) a rybího filé (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Německo) v poměru 2:1:1. V našich biologických testech byly použity larvy v pozdním třetím instaru.
Semenný materiál použitý v této studii byl získán z následujících komerčních a vládních zdrojů: Brassica juncea (hnědá hořčice - Pacific Gold) a Brassica juncea (bílá hořčice - Ida Gold) od Pacific Northwest Farmers' Cooperative, stát Washington, USA; (řeřicha zahradní) od Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA a Thlaspi arvense (pennycress polní - Elisabeth) od USDA-ARS, Peoria, IL, USA; Žádné ze semen použitých ve studii nebylo ošetřeno pesticidy. Veškerý semenný materiál byl v této studii zpracován a použit v souladu s místními a národními předpisy a v souladu se všemi příslušnými místními státními a národními předpisy. Tato studie nezkoumala transgenní odrůdy rostlin.
Semena Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), hořčice bílé (IG) a Thlaspi arvense (DFP) byla rozemleta na jemný prášek pomocí ultracentrifugálního mlýna Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Německo) vybaveného okem 0,75 mm a rotorem z nerezové oceli, 12 zubů, 10 000 ot/min (tabulka 1). Prášek z rozemletých semen byl přenesen do papírové bubínku a odtučněn hexanem v Soxhletově aparatuře po dobu 24 hodin. Podvzorek odtučněné hořčice polní byl tepelně ošetřen při 100 °C po dobu 1 hodiny, aby se denaturovala myrosináza a zabránilo se hydrolýze glukosinolátů za vzniku biologicky aktivních isothiokyanátů. Tepelně ošetřený prášek z přesličky rolní (DFP-HT) byl použit jako negativní kontrola denaturací myrosinázy.
Obsah glukosinolátů v odtučněném semenném šrotu byl stanoven trojmo pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) podle dříve publikovaného protokolu 64. Stručně řečeno, k 250 mg vzorku odtučněného semenného prášku byly přidány 3 ml methanolu. Každý vzorek byl sonikován ve vodní lázni po dobu 30 minut a ponechán ve tmě při 23 °C po dobu 16 hodin. 1 ml alikvotní podíl organické vrstvy byl poté přefiltrován přes 0,45 μm filtr do automatického vzorkovače. Obsah glukosinolátů v semenném šrotu byl stanoven trojmo pomocí softwaru Shimadzu LC Solution verze 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA) na systému Shimadzu HPLC (dvě pumpy LC 20AD; automatický vzorkovač SIL 20A; odplyňovač DGU 20As; UV-VIS detektor SPD-20A pro monitorování při 237 nm; a komunikační sběrnicový modul CBM-20A). Použitá kolona byla kolona C18 Inertsil s reverzní fází (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Počáteční podmínky mobilní fáze byly nastaveny na 12 % methanolu/88 % 0,01 M tetrabutylamoniumhydroxidu ve vodě (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) s průtokem 1 ml/min. Po injekci 15 μl vzorku byly počáteční podmínky udržovány po dobu 20 minut a poté byl poměr rozpouštědel upraven na 100 % methanolu s celkovou dobou analýzy vzorku 65 minut. Standardní křivka (na bázi nM/mAb) byla vytvořena sériovým ředěním čerstvě připravených standardů sinapinu, glukosinolátu a myrosinu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pro odhad obsahu síry v odtučněném semenném šrotu. Koncentrace glukosinolátů ve vzorcích byly testovány na HPLC systému Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) s použitím softwaru OpenLAB CDS ChemStation verze (C.01.07 SR2 [255]) vybaveného stejnou kolonou a dříve popsanou metodou. Koncentrace glukosinolátů byly stanoveny tak, aby byly srovnatelné mezi HPLC systémy.
Allylisothiokyanát (94 %, stabilní) a benzylisothiokyanát (98 %) byly zakoupeny od společnosti Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-Hydroxybenzylisothiokyanát byl zakoupen od společnosti ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Po enzymatické hydrolýze myrosinázou tvoří glukosinoláty, glukosinoláty a glukosinoláty allylisothiokyanát, benzylisothiokyanát a 4-hydroxybenzylisothiokyanát.
Laboratorní biologické testy byly provedeny podle metody Muturi et al.32 s modifikacemi. Ve studii bylo použito pět nízkotučných krmiv pro semena: DFP, DFP-HT, IG, PG a Ls. Dvacet larev bylo umístěno do 400ml jednorázové třícestné kádinky (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) obsahující 120 ml deionizované vody (dH2O). Na toxicitu pro komáry bylo testováno sedm koncentrací moučky ze semen: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 a 0,12 g moučky ze semen/120 ml dH2O pro DFP, DFP-HT, IG a PG. Předběžné biologické testy naznačují, že odtučněná mouka ze semen Ls je toxičtější než čtyři další testované moučky ze semen. Proto jsme upravili sedm koncentrací moučky z osiva Ls na následující koncentrace: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 a 0,075 g/120 ml dH2O.
Pro posouzení normální úmrtnosti hmyzu za podmínek testu byla zahrnuta neošetřená kontrolní skupina (dH20, bez přídavku semenné moučky). Toxikologické biologické testy pro každou semennou moučku zahrnovaly tři replikační kádinky se třemi sklony (20 larev pozdního třetího instaru na kádinku), celkem 108 lahviček. Ošetřené nádoby byly skladovány při pokojové teplotě (20–21 °C) a úmrtnost larev byla zaznamenávána během 24 a 72 hodin nepřetržitého vystavení ošetřeným koncentracím. Pokud se tělo a přívěsky komára při propíchnutí nebo dotyku tenkou nerezovou špachtlí nepohybují, larvy komárů se považují za mrtvé. Mrtvé larvy obvykle zůstávají nehybné v dorzální nebo břišní poloze na dně nádoby nebo na hladině vody. Experiment byl opakován třikrát v různé dny s použitím různých skupin larev, celkem 180 larev vystavených každé ošetřené koncentraci.
Toxicita AITC, BITC a 4-HBITC pro larvy komárů byla hodnocena stejným postupem biotestu, ale s odlišným ošetřením. Pro každou chemikálii se připraví zásobní roztoky o koncentraci 100 000 ppm přidáním 100 µl chemikálie k 900 µl absolutního ethanolu v 2ml centrifugační zkumavce a třepáním po dobu 30 sekund pro důkladné promíchání. Koncentrace ošetřené látky byly stanoveny na základě našich předběžných biotestů, které zjistily, že BITC je mnohem toxičtější než AITC a 4-HBITC. Pro stanovení toxicity bylo použito 5 koncentrací BITC (1, 3, 6, 9 a 12 ppm), 7 koncentrací AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 a 35 ppm) a 6 koncentrací 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 a 35 ppm, tedy 30, 45, 60, 75 a 90 ppm). Kontrolní směs byla injekčně podána s 108 μl absolutního ethanolu, což odpovídá maximálnímu objemu chemického ošetření. Biologické testy byly opakovány výše uvedeným způsobem, přičemž bylo vystaveno celkem 180 larev na ošetřenou koncentraci. Úmrtnost larev byla zaznamenána pro každou koncentraci AITC, BITC a 4-HBITC po 24 hodinách nepřetržité expozice.
Probitová analýza 65 dat o úmrtnosti související s dávkou byla provedena pomocí softwaru Polo (Polo Plus, LeOra Software, verze 1.0) za účelem výpočtu 50% letální koncentrace (LC50), 90% letální koncentrace (LC90), sklonu, koeficientu letální dávky a 95% letální koncentrace na základě intervalů spolehlivosti pro poměry letálních dávek pro logaritmicky transformované křivky koncentrace a dávky-mortality. Údaje o úmrtnosti jsou založeny na kombinovaných replikačních datech 180 larev vystavených každé koncentraci ošetření. Pravděpodobnostní analýzy byly provedeny samostatně pro každou moučku semen a každou chemickou složku. Na základě 95% intervalu spolehlivosti poměru letálních dávek byla toxicita moučky semen a chemických složek pro larvy komárů považována za významně odlišnou, takže interval spolehlivosti s hodnotou 1 se významně nelišil, P = 0,0566.
Výsledky HPLC pro stanovení hlavních glukosinolátů v odtučněných moučkách ze semen DFP, IG, PG a Ls jsou uvedeny v tabulce 1. Hlavní glukosinoláty v testovaných moučkách ze semen se lišily s výjimkou DFP a PG, které obě obsahovaly glukosinázy. Obsah myrosininu v PG byl vyšší než v DFP, 33,3 ± 1,5 a 26,5 ± 0,9 mg/g. Prášek ze semen Ls obsahoval 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglykonu, zatímco prášek ze semen IG obsahoval 38,0 ± 0,5 mg/g sinapinu.
Larvy komárů druhu Ae. Aedes aegypti byly usmrceny ošetřením odtučněným semenným šrotem, ačkoli účinnost ošetření se lišila v závislosti na druhu rostliny. Pouze DFP-NT nebyl toxický pro larvy komárů po 24 a 72 hodinách expozice (tabulka 2). Toxicita aktivního semenného prášku se zvyšovala se zvyšující se koncentrací (obr. 1A, B). Toxicita semenného šrotu pro larvy komárů se významně lišila na základě 95% intervalu spolehlivosti poměru letálních dávek hodnot LC50 při 24hodinovém a 72hodinovém hodnocení (tabulka 3). Po 24 hodinách byl toxický účinek semenného šrotu Ls větší než u jiných ošetření semenným šrotem, s nejvyšší aktivitou a maximální toxicitou pro larvy (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larvy byly po 24 hodinách méně citlivé na DFP ve srovnání s ošetřením práškem ze semen IG, Ls a PG, s hodnotami LC50 0,115, 0,04 a 0,08 g/120 ml dH2O, které byly statisticky vyšší než hodnota LC50 0,211 g/120 ml dH2O (tabulka 3). Hodnoty LC90 DFP, IG, PG a Ls byly 0,376, 0,275, 0,137 a 0,074 g/120 ml dH2O (tabulka 2). Nejvyšší koncentrace DPP byla 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 hodinách hodnocení byla průměrná úmrtnost larev pouze 12 %, zatímco průměrná úmrtnost larev IG a PG dosáhla 51 %, respektive 82 %. Po 24 hodinách hodnocení byla průměrná úmrtnost larev při ošetření semenné moučky Ls s nejvyšší koncentrací (0,075 g/120 ml dH2O) 99 % (obr. 1A).
Křivky úmrtnosti byly odhadnuty z dávkové odezvy (Probit) larev Ae. egyptského (larvy 3. instaru) na koncentraci semenné moučky 24 hodin (A) a 72 hodin (B) po ošetření. Tečkovaná čára představuje LC50 ošetření semenné moučky. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Tepelně inaktivovaná Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Při 72hodinovém hodnocení byly hodnoty LC50 semenné moučky DFP, IG a PG 0,111, 0,085 a 0,051 g/120 ml dH2O. Téměř všechny larvy vystavené semenné moučce Ls uhynuly po 72 hodinách expozice, takže údaje o úmrtnosti nebyly v souladu s Probitovou analýzou. Ve srovnání s jinými semennými moučkami byly larvy méně citlivé na ošetření semennou moučkou DFP a měly statisticky vyšší hodnoty LC50 (tabulky 2 a 3). Po 72 hodinách byly hodnoty LC50 pro ošetření semennou moučkou DFP, IG a PG odhadovány na 0,111, 0,085 a 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 hodinách hodnocení byly hodnoty LC90 semenných prášků DFP, IG a PG 0,215, 0,254 a 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 hodinách hodnocení byla průměrná úmrtnost larev u ošetření semennou moučkou DFP, IG a PG při maximální koncentraci 0,12 g/120 ml dH2O 58 %, 66 % a 96 % (obr. 1B). Po 72hodinovém hodnocení bylo zjištěno, že semenná moučka PG je toxičtější než semenná moučka IG a DFP.
Syntetické isothiokyanáty, allylisothiokyanát (AITC), benzyllisothiokyanát (BITC) a 4-hydroxybenzyllisothiokyanát (4-HBITC) dokáží účinně hubit larvy komárů. 24 hodin po ošetření byl BITC pro larvy toxičtější s hodnotou LC50 5,29 ppm ve srovnání s 19,35 ppm pro AITC a 55,41 ppm pro 4-HBITC (tabulka 4). Ve srovnání s AITC a BITC má 4-HBITC nižší toxicitu a vyšší hodnotu LC50. V nejúčinnější semenné moučce existují významné rozdíly v toxicitě dvou hlavních isothiokyanátů (Ls a PG) pro komáry. Toxicita založená na poměru letálních dávek hodnot LC50 mezi AITC, BITC a 4-HBITC ukázala statistický rozdíl tak, že 95% interval spolehlivosti poměru letálních dávek LC50 nezahrnoval hodnotu 1 (P = 0,05, tabulka 4). Odhaduje se, že nejvyšší koncentrace BITC i AITC usmrtily 100 % testovaných larev (obrázek 2).
Křivky úmrtnosti byly odhadnuty z závislosti na dávce (Probit) Ae. 24 hodin po ošetření dosáhly egyptské larvy (larvy 3. instaru) koncentrací syntetických isothiokyanátů. Tečkovaná čára představuje LC50 pro ošetření isothiokyanátem. Benzyl isothiokyanát BITC, allyl isothiokyanát AITC a 4-HBITC.
Použití rostlinných biopesticidů jako prostředků pro hubení přenašečů komárů je již dlouho studováno. Mnoho rostlin produkuje přírodní chemikálie, které mají insekticidní aktivitu37. Jejich bioaktivní sloučeniny představují atraktivní alternativu k syntetickým insekticidům s velkým potenciálem v hubení škůdců, včetně komárů.
Hořčice se pěstuje jako plodina pro svá semena, používá se jako koření a zdroj oleje. Když se ze semen extrahuje hořčičný olej nebo když se hořčice extrahuje pro použití jako biopalivo,69 vedlejším produktem je odtučněná moučka ze semen. Tato moučka si zachovává mnoho svých přirozených biochemických složek a hydrolytických enzymů. Toxicita této moučky se připisuje produkci isothiokyanátů55,60,61. Isothiokyanáty vznikají hydrolýzou glukosinolátů enzymem myrosinázou během hydratace moučky ze semen38,55,70 a je známo, že mají fungicidní, baktericidní, nematocidní a insekticidní účinky, stejně jako další vlastnosti včetně chemických senzorických účinků a chemoterapeutických vlastností61,62,70. Několik studií ukázalo, že rostliny hořčice a moučka ze semen účinně působí jako fumiganty proti půdním škůdcům a škůdcům v uskladněných potravinách57,59,71,72. V této studii jsme hodnotili toxicitu čtyřsemenné moučky a jejích tří bioaktivních produktů AITC, BITC a 4-HBITC pro larvy komára rodu Aedes. Aedes aegypti. Očekává se, že přidání moučky ze semen přímo do vody obsahující larvy komárů aktivuje enzymatické procesy, které produkují isothiokyanáty toxické pro larvy komárů. Tato biotransformace byla částečně prokázána pozorovanou larvicidní aktivitou moučky ze semen zakrslé hořčice a ztrátou insekticidní aktivity, když byla moučka ze semen zakrslé hořčice před použitím tepelně ošetřena. Očekává se, že tepelné ošetření zničí hydrolytické enzymy, které aktivují glukosinoláty, a tím zabrání tvorbě bioaktivních isothiokyanátů. Toto je první studie, která potvrzuje insekticidní vlastnosti prášku ze semen zelí proti komárům ve vodním prostředí.
Mezi testovanými prášky ze semen byl prášek ze semen řeřichy lékařské (Ls) nejtoxičtější a způsoboval vysokou úmrtnost druhu Aedes albopictus. Larvy Aedes aegypti byly zpracovávány nepřetržitě po dobu 24 hodin. Zbývající tři prášky ze semen (PG, IG a DFP) měly pomalejší aktivitu a stále způsobovaly významnou úmrtnost i po 72 hodinách nepřetržitého ošetření. Pouze moučka ze semen Ls obsahovala významné množství glukosinolátů, zatímco PG a DFP obsahovaly myrosinázu a IG obsahoval glukosinolát jako hlavní glukosinolát (tabulka 1). Glukotropaeolin se hydrolyzuje na BITC a sinalbin se hydrolyzuje na 4-HBITC61,62. Výsledky našich biologických testů ukazují, že jak moučka ze semen Ls, tak syntetický BITC jsou pro larvy komárů vysoce toxické. Hlavní složkou moučky ze semen PG a DFP je glukosináza, glukosinolát, který se hydrolyzuje na AITC. AITC je účinný při hubení larev komárů s hodnotou LC50 19,35 ppm. Ve srovnání s AITC a BITC je 4-HBITC isothiokyanát nejméně toxický pro larvy. Přestože je AITC méně toxický než BITC, jeho hodnoty LC50 jsou nižší než u mnoha esenciálních olejů testovaných na larvách komárů32,73,74,75.
Náš prášek ze semen brukvovitých rostlin určený k použití proti larvám komárů obsahuje jeden hlavní glukosinolát, který představuje více než 98–99 % celkového množství glukosinolátů, stanoveno pomocí HPLC. Byla detekována stopová množství dalších glukosinolátů, ale jejich hladiny byly nižší než 0,3 % celkového množství glukosinolátů. Prášek ze semen řeřichy seté (L. sativum) obsahuje sekundární glukosinoláty (sinigrin), ale jejich podíl je 1 % celkového množství glukosinolátů a jejich obsah je stále nevýznamný (přibližně 0,4 mg/g prášku ze semen). Ačkoli PG a DFP obsahují stejný hlavní glukosinolát (myrosin), larvicidní aktivita jejich semenných mouček se významně liší v důsledku hodnot LC50. Liší se v toxicitě vůči padlí. Vznik larev Aedes aegypti může být způsoben rozdíly v aktivitě myrosinázy nebo stabilitě mezi těmito dvěma druhy krmiva pro osivo. Aktivita myrosinázy hraje důležitou roli v biologické dostupnosti produktů hydrolýzy, jako jsou isothiokyanáty, v rostlinách čeledi Brukvovité76. Předchozí zprávy Pococka a kol.77 a Wilkinsona a kol.78 ukázaly, že změny v aktivitě a stabilitě myrosinázy mohou být také spojeny s genetickými a environmentálními faktory.
Očekávaný obsah bioaktivních isothiokyanátů byl vypočítán na základě hodnot LC50 každého semenného moučky po 24 a 72 hodinách (tabulka 5) pro srovnání s odpovídajícími chemickými aplikacemi. Po 24 hodinách byly isothiokyanáty v semenné moučce toxičtější než čisté sloučeniny. Hodnoty LC50 vypočítané na základě počtu ppm isothiokyanátů po ošetření semen byly nižší než hodnoty LC50 pro aplikace BITC, AITC a 4-HBITC. Pozorovali jsme larvy konzumující pelety semenné moučky (obrázek 3A). V důsledku toho mohou být larvy požitím pelet semenné moučky vystaveny koncentrovanější expozici toxickým isothiokyanátům. To bylo nejzřetelnější u ošetření semenné moučky IG a PG při 24hodinové expozici, kde byly koncentrace LC50 o 75 % a 72 % nižší než u ošetření čistým AITC a 4-HBITC. Ošetření Ls a DFP byla toxičtější než čistý isothiokyanát, s hodnotami LC50 o 24 % a 41 % nižšími. Larvy v kontrolní skupině se úspěšně zakuklily (obr. 3B), zatímco většina larev v skupině s moučkou se nezakuklila a vývoj larev byl významně zpožděn (obr. 3B,D). U Spodopteralitura jsou isothiokyanáty spojovány s retardací růstu a vývojovým zpožděním79.
Larvy komárů druhu Ae. Aedes aegypti byly nepřetržitě vystaveny prášku ze semen rodu Brassica po dobu 24–72 hodin. (A) Mrtvé larvy s částicemi moučky ze semen v tlamových ústrojích (zakroužkované); (B) Kontrolní ošetření (dH20 bez přidané moučky ze semen) ukazuje, že larvy rostou normálně a začínají se kuklit po 72 hodinách. (C, D) Larvy ošetřené moučkou ze semen; moučka ze semen vykazovala rozdíly ve vývoji a nezakuklila se.
Mechanismus toxických účinků isothiokyanátů na larvy komárů jsme dosud nestudovali. Předchozí studie na červených mravencích ohnivých (Solenopsis invicta) však ukázaly, že inhibice glutathion-S-transferázy (GST) a esterázy (EST) je hlavním mechanismem bioaktivity isothiokyanátů a AITC, a to i při nízké aktivitě, může také inhibovat aktivitu GST. červení importovaní mravenci ohniví v nízkých koncentracích. Dávka je 0,5 µg/ml80. Naproti tomu AITC inhibuje acetylcholinesterázu u dospělých nosatců kukuřičných (Sitophilus zeamais)81. Podobné studie je třeba provést k objasnění mechanismu aktivity isothiokyanátů u larev komárů.
Používáme tepelně inaktivovanou DFP k podpoře tvrzení, že hydrolýza rostlinných glukosinolátů za vzniku reaktivních isothiokyanátů slouží jako mechanismus pro kontrolu larev komárů pomocí hořčičné moučky. Semenná moučka DFP-HT nebyla při testovaných aplikačních dávkách toxická. Lafarga a kol.82 uvedli, že glukosinoláty jsou citlivé na degradaci při vysokých teplotách. Očekává se také, že tepelné ošetření denaturuje enzym myrosinázu v semenné moučce a zabrání hydrolýze glukosinolátů za vzniku reaktivních isothiokyanátů. To potvrdili i Okunade a kol.75, kteří ukázali, že myrosináza je citlivá na teplotu, což ukazuje, že aktivita myrosinázy byla zcela inaktivována, když byla semena hořčice, černé hořčice a krvavé hořčice vystavena teplotám nad 80 °C. Tyto mechanismy mohou vést ke ztrátě insekticidní aktivity tepelně ošetřené semenné moučky DFP.
Hořčičná moučka a její tři hlavní isothiokyanáty jsou tedy pro larvy komárů toxické. Vzhledem k těmto rozdílům mezi moučkou ze semen a chemickým ošetřením může být použití moučky ze semen účinnou metodou hubení komárů. Je třeba identifikovat vhodné formulace a účinné systémy podávání, které by zlepšily účinnost a stabilitu použití prášků ze semen. Naše výsledky naznačují potenciální využití moučky ze semen hořčice jako alternativy k syntetickým pesticidům. Tato technologie by se mohla stát inovativním nástrojem pro kontrolu přenašečů komárů. Protože larvy komárů prosperují ve vodním prostředí a glukosinoláty ze moučky se po hydrataci enzymaticky přeměňují na aktivní isothiokyanáty, nabízí použití moučky ze semen hořčice ve vodě zamořené komáry významný kontrolní potenciál. Ačkoli se larvicidní aktivita isothiokyanátů liší (BITC > AITC > 4-HBITC), je zapotřebí dalšího výzkumu, aby se zjistilo, zda kombinace moučky ze semen s více glukosinoláty synergicky zvyšuje toxicitu. Toto je první studie, která prokazuje insekticidní účinky odtučněné moučky ze semen brukvovitých a tří bioaktivních isothiokyanátů na komáry. Výsledky této studie přinášejí nový průlom tím, že ukazují, že odtučněná moučka ze semen zelí, vedlejší produkt extrakce oleje ze semen, může sloužit jako slibný larvicidní prostředek pro hubení komárů. Tyto informace mohou pomoci s dalším objevem látek pro biokontrolu rostlin a jejich vývojem jako levných, praktických a ekologických biopesticidů.
Datové soubory generované pro tuto studii a výsledné analýzy jsou k dispozici u příslušného autora na základě přiměřené žádosti. Na konci studie byly veškeré materiály použité ve studii (hmyz a semenná moučka) zničeny.
Čas zveřejnění: 29. července 2024